Chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh trong nước nuôi trồng thủy sản. Để có được mẫu nước hồ nuôi cá Bớp, chúng tôi đã tiến hành liên lạc với trang trại sản xuất thủy sản giống ở Phú Yên. Sau khi liên hệ, chúng tôi được cung cấp chi tiết về số các kháng sinh và thời gian sử dụng từng loại kháng sinh cho hồ nuôi. Mẫu nước được thu thập ngẫu nhiên tại 5 vị trí của hồ nuôi cá Bớp đang trong giai đoạn sinh trưởng. Chúng tôi sẽ tiến hành phân tích để kiểm chứng điều này bằng 2 phương pháp: sử dụng cảm biến do chúng tôi chế tạo và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Quy trình phân tích được trình bày trên hình 2.7.
Đầu tiên chúng tôi xử lý mẫu nước của hồ nuôi cá Bớp. Nước hồ nuôi của trang trại được bảo quản lạnh với nhiệt độ 4oC. Nước được đổvào bình định mức để lắng hết phần đục, chúng tôi lấy 70% lượng nước ở phần trên của bình. Sau đó chúng tôi tiến hành phân tích điện hóa. Đểphân tích chúng tôi pha nước trong hỗn hợp của axit axetic (10%) với tỷ lệ 9:1 và rung siêu âm trong 5 phút để có thể hòa tan toàn bộ kháng sinh NOR trong hỗn hợp nước. Sau đó, nước của hồnuôi được tiến hành phân tích cảm biến đã chế tạo theo phương pháp 2 (trộn hạt keo vàng kích thước 10 nm vào dung dịch polyme). Đầu tiên 2 µL mẫu nước đã qua xửlý được nhỏ lên cảm biến và để trong 15 phút. Sau khi rửa sạch, cảm biến được phân tích điện hóa. Giá trịđiện trở truyền điện tích được lấy làm giá trị đầu ra của cảm biến. Giá trị điện trở truyền điện tích được so sánh với đường chuẩn đã được xác định, từđó tìm ra được dư lượng kháng sinh trong mẫu. Để kiểm chứng độ thu hồi nếu như có kháng sinh trong mẫu nước, chúng tôi tiến hành thêm kháng sinh chuẩn vào nước hồ nuôi và tiến hành phân
38
tích như trên. Kết quả cho thấy cảm biến có độ thu hồi cao (> 95%). Để kiểm chứng độ lặp lại, chúng tôi tiến hành phân tích 3 mẫu nước cũng được chuẩn bịnhư trên và tiến hành đo nồng độtương tựnhư mẫu đã phân tích.
Hình 2.7. Quy trình phân tích xác định hàm lượng kháng sinh Norfloxacin của mẫu nước hồ
nuôi thủy sản theo 2 phương pháp EIS và HPLC.
Song song với phân tích điện hóa, mẫu nước cũng được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Đểxác định dư lượng kháng sinh trong nước hồ nuôi, chúng tôi cần xây dựng đường chuẩn xác định mẫu chuẩn kháng sinh Norfloxacin. Kháng sinh Norfloxacin (NOR) được mua từ Sigma với độ sạch 98% được sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Đầu tiên 12,5 mg kháng sinh NOR được cân chính xác và pha trong bình định mức 25mL. Dung môi sử dụng là hỗn hợp dung dịch axit acetic (CH3COOH 5%) và methanol theo tỉ lệ 4:1. Hỗn hợp được rung siêu âm trong 30 phút để làm tan hoàn toàn kháng sinh trong hỗn hợp. Dung dịch chuẩn thu được có nồng độ 500 µg/mL. Để tiến hành đo, dung dịch chuẩn được pha loãng (trong nước tinh khiết) xuống các nồng độ cần thiết trong bình định mức 10 mL. Trước khi được tiêm vào hệ thống HPLC, dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm. 10 mL mẫu chuẩn đã được tiêm vào hệ thống HPLC. Sau đó mẫu được bơm vào pha rắn với thời
39
gian bơm là 10 phút mỗi phút 1,0 mL. Tất cả các phân tích được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Kết quả được thu thập và xử lý bởi phần mềm nội bộ (Empower, Waters, Milford, MA, USA). Kết quảthu được bao gồm đỉnh tại thời gian lưu của kháng sinh Norfloxacin và diện tích đỉnh đó được ghi lại. Biểu đồđường chuẩn (nồng độ so với diện tích đỉnh tại thời gian lưu) được xây dựng ở sáu mức nồng độ (10, 20, 30, 50, 100, 150, 200 ng/mL). Độ dốc và độ tuyến tính của đường đặc trưng chuẩn đã được ghi lại. Sau khi dựng đường chuẩn của phương pháp HPLC, chúng tôi xácđịnh hàm lượng của NOR trong mẫu nước hồ nuôi cá Bớp. Sau khi để lắng lấy phần trong như đã mô tảở trên. Mẫu nước hồnuôi được pha loãng trong hỗn hợp axit acetic 5% và methanol với tỷ lệ 4:1. Mẫu nước được đong trong bình định mức 10 mL. Để tiêm được vào hệ thống HPLC mẫu nước đã được lọc qua màng lọc 0,45 µm. Để phân tích, mẫu được bơm vào pha rắn với thời gian 10 phút mỗi phút 1 mL. Sau khi thu được kết quả, chúng tôi tiến hành thêm mẫu chuẩn vào mẫu nước của hồ trong bình định mức 10 mL sao cho nồng độ thêm vào là 20, 40, 60 ppb. Kết quảđược so sánh với đường chuẩn đã xây dựng ởtrên đểtính độ thu hồi.
2.3.2. Phân tích hàm lượng kháng sinh Norfloxacin trong dược phẩm
Ngoài phân tích dư lượng kháng sinh NOR trong nước nuôi thủy sản, chúng tôi phân tích hàm lượng kháng sinh trong NOR trong dược phẩm. Thuốc kháng sinh NOR 400 mg có thành phần bao gồm 400 mg kháng sinh Norfloxacin và tá dược (xem hình 2.8). Thuốc kháng sinh này chỉ điều trị nhiễm khuẩn và sẽ không dùng cho điều trị nhiễm virus (ví dụnhư cảm lạnh thông thường hoặc cúm). Đây là một loại kháng sinh phổ biến và bán khá nhiều trên thị trường. Chúng ta có thể dễ dàng mua được chúng từ hiệu thuốc mà không cần chỉ định của bác sĩ. Chúng tôi sẽ xác định hàm lượng của kháng sinh Norfloxacin trong thuốc theo hai phương pháp: sử dụng phương pháp quang phổ UV-vis và cảm biến NOR-MIP/EIS.
Hình 2.8. Thuốc kháng sinh Norfloxacin 400 mg.
Quy trình phân tích được thể hiện trên hình 2.9. Sau khi mua được kháng sinh dưới dạng viên nén chúng tôi tiến hành nghiền nhỏ viên thuốc thành dạng bột bằng cách sử dụng cối nghiền. Hỗn hợp thu được được trộn đồng nhất và được hòa tan trong 20 mL dung dịch axit acetic đểthu được hồn hợp của thuốc và axit acetic 1%. Hỗn hợp được rung siêu âm trong 20 phút để hòa tan toàn bộ kháng sinh Norfloxacin. Sau đó
40
hỗn hợp được lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm. Cuối cùng hỗn hợp được đem quay ly tâm với tốc độ 6000 rpm trong 5 phút. Sau đó chúng tôi pha loãng hỗn hợp dung dịch 20.000 lần (20 µg/mL), 40.000 lần (10 µg/mL), 200.000 lần (2 µg/mL) để tiến hành phân tích UV-vis và pha loãng xuống 400.000.000 lần (1 ng/mL) để phân tích điện hóa. Sau khi được pha loãng lần lượt từng nồng độ, thuốc được đem phân tích bằng cách nhỏ 2 µL dung dịch lên cảm biến điện hóa NOR-MIP được chế tạo theo phương pháp như đã được mô tả ở trên. Sau 15 phút cảm biến được rửa sạch bằng nước cất 2 lần và sấy khô và được phân tích điện hóa. Giá trị điện trở truyền điện tích chênh lệch giữa trước và sau khi nhỏ dung dịch kháng sinh ΔRCTđược ghi lại. So sánh giá trị trên vào giá trị đường chuẩn đã thu được chúng tôi thu được giá trị nồng độđã phát hiện được.
Hình 2.9. Quy trình xác định nồng độ kháng sinh Norfloxacin trong thuốc kháng sinh
41
Để phân tích hàm lượng kháng sinh trong dược phẩm bằng phương pháp UV- vis, chúng tôi cần xây dựng đường chuẩn để xác định nồng độ của mẫu chuẩn kháng sinh NOR. Mẫu chuẩn NOR (98%) được cân và pha loãng trong acid acetic 1% đểđạt được nồng độ 10 mg/mL. Sau đó mẫu được pha loãng thành nhiều mẫu mỗi mẫu có nồng độ xác định từ 1µg/mL đến 40 µg/mL. Đường đặc trưng chuẩn được xây dựng theo sự phụ thuộc của nồng độ và diện tích của đỉnh lớn nhất. Chúng tôi phân tích với dải bước sóng từ 200 đến 400 nm do kháng sinh Norfloxacin thuộc họquinolone có đặc tính hấp thụ mạnh trong tia cực tím.
Đầu tiên 3 mL của axit actetic 1 % được chọn đo và chọn giá trị đo được của 3mL trên làm nền. Sau đó, 3 mL của nồng độ mẫu chuẩn được cho vào cuvet và phân tích. Sau khi phân tích dải nồng độ từ 1µg/mL đến 40 µg/mL, giá trị diện tích của đỉnh lớn nhất trên từng nồng độ được ghi lại. Chúng tôi tiến hành phân tích mỗi nồng độ 3 lần và lấy giá trị trung bình của đỉnh lớn nhất. Đường chuẩn của phương pháp được xây dựng dựa trên sự thay đổi của giá trị trung bình diện tích của đỉnh đặc trưng lớn nhất theo từng nồng độ. Để phân tích mẫu thuốc chúng tôi pha loãng mẫu thuốc xuống 20.000 lần (20 µg/mL) 40.000 lần (10 µg/mL) 200.000 lần (2 µg/mL). Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả ở 3 nồng độ trên 3 lần và thu được kết quả có độ sai số rất thấp (< 3%). Kết quảtrung bình được so sánh với đường chuẩn đã xây dựng ở trên để xác định hàm lượng kháng sinh Norfloxacin trong thuốc kháng sinh Norfloxacin 400 mg.
2.4. Các thông số đánh giá hoạt động của cảm biến2.4.1. Độ nhạy của cảm biến 2.4.1. Độ nhạy của cảm biến
Độ nhạy là tính đáp ứng tín hiệu của cảm biến khi thay đổi nồng độ chất cần phân tích hay khả năng phát hiện sựthay đổi tín hiệu tín hiệu khi có sựthay đổi về nồng độ chất cần phân tích. Đối với cảm biến phổ tổng trở, độ nhạy của cảm biến được xác định bởi tỷ số giữa sựthay đổi của giá trịđiện trở truyền điện tích ∆Rct và sựthay đổi nồng độ chất phân tích tương ứng ∆C theo công thức:
ct R S C ∆ = ∆
2.4.2. Khoảng tuyến tính của cảm biến
Khoảng tuyến tính của cảm biến được xác định từ giá trị nồng độđịnh lượng thấp nhất của cảm biến đến giá trị nồng độ lớn nhất mà tín hiệu đáp ứng của cảm biến tuân theo phương trình tuyến tính bậc nhất. Với mục tiêu nghiên cứu cảm biến phát hiện các phân tử nhỏ trong cảnh báo sớm nên khoảng nồng độ khảo sát cũng như khoảng tuyến tính sẽtương ứng với mức độ cảnh báo của từng chất phân tích.
42 2.4.3. Độ lặp lại của cảm biến
Độ lặp lại của cảm biến được xác định thông qua khảo sát hoạt động của 3-10 cảm biến độc lập được chế tạo với cùng quy trình thực nghiệm và được khảo sát tại cùng nồng độ chất phân tích.
2.4.4. Giới hạn phát hiện của cảm biến
Giới hạn phát hiện của cảm biến được xác định theo quy tắc 3σ (3 lần độ lệch chuẩn của mức nhiễu trung bình) và được tính toán theo công thức:
3. = STDEV LOD Slope Trong đó: - LOD là giới hạn phát hiện của cảm biến. - Slope là độ dốc của đường chuẩn.
- STDEV là giá trị độ lệch chuẩn của mẫu trắng (blank) và được xác định theo công thức với đó n là số mẫu trắng được lựa chọn khảo sát, yi là giá trịđo của mẫu trắng ở lần đo thứ i và y là giá trị trung bình của n mẫu trắng.
( )2 1 1 n i i y y STDEV n = − = − ∑ 2.4.5. Độ chọn lọc của cảm biến
Độ chọn lọc của cảm biến được khảo sát bằng cách đo tín hiệu khi cho cảm biến tiếp xúc với môi trường chứa phân tử chất có cấu trúc hóa học và kích thước gần giống với chất phân tích hoặc trong môi trường chứa đồng thời cả chất phân tích và chất có cấu trúc hóa học tương tự.
2.5. Các phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp phân tích phổ Raman
Phương pháp phổ tán xạ Raman là một công cụ hỗ trợ hữu hiệu để nghiên cứu, xác định thành phần cũng như tính chất vật lý và cấu trúc hóa học của vật liệu, chất phân tích. Phương pháp đo phổ tán xạRaman được xây dựng trên hiệu ứng Raman, hiệu ứng được mô tả là các dao động rung và xoay của phân tử làm thay đổi mức năng lượng của chúng, nguyên nhân là do sự tán xạkhông đàn hồi của photon lên vật chất (phân tử, nguyên tử, ion...). Trong quá trình tương tác của bức xạ với phân tử, trường điện từ của photon tới làm biến dạng đám mây electron xung quanh hạt nhân và tạo ra trạng thái có thời gian sống rất ngắn gọi là “trạng thái giảkích thích”. Trong trường hợp photon tới có năng lượng nhỏkhông đủđểkích thích điện tử lên mức năng lượng cao hơn thì nó có thể bị tán xạ thành hai loại là tán xạđàn hồi (tán xạ Rayleigh) và
43
tán xạ không đàn hồi. Chính những tán xạ không đàn hồi này đã tạo nên hiệu ứng Raman. Các tán xạkhông đàn hồi của điện tử với photon có thể giải thích đơn giản như sau, phân tửở trạng thái dao động cơ bản (υ = 0) có thể hấp thụ năng lượng và chuyển lên trạng thái dao động giảkích thích, sau đó phát xạ photon và chuyển xuống mức có năng lượng cao hơn (υ = 1), đó là tán xạ Stokes. Tuy nhiên, một số phân tử có thểđang chiếm trạng thái kích thích do năng lượng nhiệt, và khi tham gia quá trình tán xạ các phân tử này có thể chuyển từ trạng thái kích thích (υ = 1) lên trạng thái giả kích thích và phát xạ photon trở về trạng thái cơ bản (υ = 0), tán xạ này gọi là tán xạ anti-Stoke (hình 2.10).
Hình 2.10. Mô hình tán xạ Rayleigh, Stoke và anti-Stoke.
Chức năng cơ bản của một phổ kế Raman là loại bỏ tán xạđàn hồi Rayleigh và phát hiện các thành phần phổ tán xạ không đàn hồi Raman có cường độ thấp, vì vậy nguồn bức xạ của phổ kế phải là một nguồn đơn sắc, độ nhạy của phổ kếcao để có thểthu được các tín hiệu tán xạkhông đàn hồi với cường độ rất nhỏ, hiệu suất hội tụ lớn. Bên cạnh các hệ đo tán xạ Raman thông thường, khoa học đã phát triển thêm nhiều hệđo khác như cộng hưởng Raman, hiển vi Raman, và FT-Raman, nhằm tăng cường độ tín hiệu Raman thu được cũng như khắc phục vấn đềảnh hưởng do huỳnh quang. Theo phân bố Maxwell-Boltzmann, ở nhiệt độ phòng, có thể coi hầu hết các dao động phân tửđều ở trạng thái cơ bản, vì vậy các tán xạ anti-Stokes có cường độ yếu hơn rất nhiều so với các tán xạ Stokes, dẫn đến cường độ vạch phổ Stoke lớn hơn nhiều so với vạch phổ anti-Stokes. Trong các hệ đo thực tế, phổ Raman thu được thường chỉ gồm các vạch phổứng với tán xạ Stokes.
2.5.2. Phương pháp phân tích phổ UV-vis
Phân tích quang phổ là một trong những phương pháp phân tích thông dụng thường được sử dụng đểxác định thành phần hóa học, cấu trúc cũng như các tính chất vật lý, hóa học của chất cần phân tích. Cùng với sự phát triển của khoa học, kĩ thuật, các phương pháp phân tích đặc trưng quang ngày càng chính xác, đa dạng và phong phú hơn mang lại nhiều lựa chọn cho người sử dụng tùy vào mục đích nghiên cứu. Một
44
trong những phương pháp phân tích quang phổđược ứng dụng rộng rãi bởi khảnăng phân tích định tính cũng như định lượng một cách chính xác cùng với giá thành không quá cao phải kểđến đó là phương pháp phân tích phổ hấp thụ UV-vis. Cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích phổ hấp thụ UV-visdựa trên hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ của các nguyên tử. Hiện tượng này có thể miêu tả bằng việc cường độ sáng của một chùm sáng có xu hướng giảm sau khi đi qua một môi trường vật chất (I < I0) như trình bày trên hình 2.11.
Hình 2.11. Cường độ sáng của chùm sáng giảm khi đi qua môi trường vật chất.
Giải thích cho hiện tượng hấp thụ bức xạđiện từ của môi trường vật chất là do sự tương tác giữa điện trường của sóng điện từ có tần sốω với môi trường vật chất. Các điện tử trong nguyên tử sẽ bịthay đổi vị so với hạt nhân và dao động điều hòa với tần số bằng tần số của sóng tới, khi đó các điện tử trở thành nguồn photon thứ cấp. Sự xuất hiện nguồn thứ cấp sẽ dẫn tới sự giao thoa giữa sóng tới và sóng thứ cấp và tạo thành các sóng có biên độ khác với biên độ của sóng tới. Kết quả của sự giao thoa là