phương pháp phổ tổng trở điện hóa
Trên hình 5.23 trình bày phổ EIS của cảm biến CF-MIP và cảm biến NIP trước và sau khi được nhúng vào môi trường có chứa CF với nồng độ xác định. Kết quả cho thấy đường kính bán cung Nyquist của cảm biến CF-MIP tăng lên tương ứng với sựgia tăng nồng độ kháng sinh CF trong khi sự thay đổi này là rất nhỏ đối với cảm biến NIP. Thông qua khớp phổ EIS sử dụng mạch tương đương Randles, của cảm biến CF-MIP trong dải nồng độ kháng sinh CF từ0 ng/mL đến
114
13,24 ng/mL, giá trị điện trở truyền điện tích RCTtăng từ 0,12 kΩ đến 17,45 kΩ, trong khi đó với cảm biến NIP chỉ thay đổi cỡ 400 Ω trong dải nồng độ CF từ 0 ng/mL đến 33,1 µg/mL. Kết quả này cho thấy sự thay đổi của tín hiệu cảm biến (RCT) hoàn toàn là do sự tái liên kết của các phân tử CF với khuôn in đặc hiệu của chúng (đầu thu CF-MIP).
Hình 5.23. Phổ tổng trở điện hóa cảm biến A) CF-MIP và B) Cảm biến NIP.
Tiến hành xây dựng đường đặc trưng chuẩn của cảm biến CF-MIP thể hiện sự phụ thuộc của ∆RCT (sự thay đổi giá trị RCT của cảm biến tại nồng độ kháng sinh CF so với mẫu trắng) vào nồng độ kháng sinh CF (hình 5.24). Đường đặc trưng chuẩn được chia thành hai vùng tuyến tính ứng với nồng độ CF từ0,33 ng/mL đến 3,31 ng/mL và từ3,31 ng/mL đến 13,24 ng/mL.
Hình 5.24. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến CF-MIP với ∆RCT (kΩ) là hàm của nồng
độ CF (ng/mL). Tất cả các điểm đo trên đồ thị là giá trị trung bình của 03 cảm biến được chế tạo độc lập sử dụng cùng quy trình và thanh sai số chính là giá trị độ lệch chuẩn (cỡ 5 %).
Kết quả cho thấy cảm biến CF-MIP có khả năng phân tích định lượng kháng sinh CF trong dải nồng độ rộng từ 0,33 ng/mL đến 13,24 ng/mL. Sự phân thành hai vùng tuyến tính trên đặc trưng chuẩn có thểđược giải thích là do sốlượng đầu
115
thu CF-MIP có trên bề mặt điện cực. Ở nồng độ CF thấp (thấp hơn 3,31 ng/mL - 10 nM), số lượng đầu thu CF-MIP nhiều hơn nhiều so với số phân tửCF đến bề mặt điện cực làm cho xác suất phân tử CF có khảnăng tới tái liên kết với đầu thu cao dẫn tới sự thay đổi mạnh của RCT trong khi sự thay đổi nồng độ CF nhỏ (khoảng 1 nM). Ở vùng tuyến tính thứ hai (từ3,31 ng/mL đến 13,24 ng/mL), mặc dù nồng độ CF thay đổi cỡ 5 nM nhưng RCT tăng chậm có thể được giải thích là do bắt đầu chịu ảnh hưởng của sự hạn chế của số lượng đầu thu CF-MIP trên bề mặt điện cực cảm biến. Giới hạn phát hiện (LOD) của cảm biến tại hai vùng nồng độ từ 0,33 ng/mL đến 3,31 ng/mLvà từ3,31 ng/mL đến 13,24 ng/mL tương ứng lần lượt là 6,0 pg/mL và 15,4 pg/mL.
5.5.2.3. Xác định hàm lượng kháng sinh CF trong dược phẩm
Mẫu dược phẩm mà chúng tôi sử dụng để phân tích là mẫu thuốc nhỏ mắt có tên là Prolaxi được sản xuất bởi công ty Atco Laboratories., Ltd - Pakistan với thành phần Ciprofloxacin 0,3%. Thông tin về sản phẩm thuốc được trình bày trên hình 5.25.
Hình 5.25. Thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0,3% của hãng Atco Laboratories., Ltd – Pakistan.
Để phân tích hàm lượng CF có trong thuốc nhỏ mắt, chúng tôi đã sử dụng cảm biến đã chế tạo. Trên hình 5.26 trình bày phổ EIS của cảm biến CF-MIP và cảm biến NIP khi tiếp xúc với dung dịch thuốc nhỏ mắt với được pha loãng với số lần xác định. Kết quả cho thấy, đường kính của bán cung trên phổ EIS của cảm biến CF-MIP thay đổi rõ rệt khi tiếp xúc với thuốc nhỏ mắt, giá trị biến thiên điện trở truyền điện tích ∆RCT tăng từ 2,3 kΩ đến 6,5 kΩ khi nồng độ thuốc nhỏ mắt tăng lên từ 0,99 ng/mL đến 2,79 ng/mL. Trái lại, đối với cảm biến NIP sự thay đổi về đường kính bán cung là không đáng kể. Điều này chứng tỏ cảm biến đã chế tạo hoạt động tốt trong môi trường mẫu thực.
116
Hình 5.26. Đặc trưng EIS phân tích mẫu thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0.3% tại các nồng độ khác
nhau của (A) Cảm biến CF-MIP và (B) Cảm biến NIP.
Trên bảng 5.11 trình bày kết quả phân tích mẫu thuốc nhỏ mắt của cảm biến CF- MIP/EIS đã chế tạo. Tại nồng độ 0,99 ng/mL theo giá trị niêm yết của hãng, cảm biến CF-MIP/EIS phát hiện được nồng độ là 0,89 ng/mL, nhỏ hơn giá trị niêm yết của hãng. Tương tự như vậy, tại nồng độ 1,89 ng/mL và 2,79 ng/mL cảm biến CF- MIP/EIS phát hiện được nồng độ tương ứng là 1,94 ng/mL và 2,89 ng/mL.
Bảng 5.11. Kết quả phân tích định lượng nồng độ kháng sinh CF trong mẫu thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0,3% bằng cảm biến CF-MIP.
Theo đường chuẩn
∆RCT (Ω) = 2391,2*C (ng/mL) – 123,9 Đo thực nghiệm Sai số tương đối (%) Nồng độ CF theo giá trị niêm yết của hãng ∆RCT(Ω) ∆RCT(Ω) Nồng độ CF thực phát hiện 0,99 2343,4 2254,5 0,89 10,0 1,89 4395,5 4521,5 1,94 2,6 2,79 6547,5 6780,5 2,89 3,6
Như vậy kết quả cho thấy, với mẫu thực có nồng độ CF thấp hơn 1 ng/mL thì sai số tương đối giữa thực nghiệm và đường chuẩn là 10 %. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn thì sai số này rất nhỏ chỉ từ 2,6 đến 3,6 %. Căn cứ vào bảng giá trị này chúng tôi xác định được nồng độ kháng sinh CF có trong thuốc nhỏ mắt có giá trị nằm trong khoảng từ 3,02 mg/mL đến 3,10 mg/mL. Giá trị này hoàn toàn phù hợp với sai số ghi trên bao bì của sản phẩm là sai số nồng độ CF sử dụng trong sản phẩm có giá trị từ0,5% đến 3,5% (trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế).
Đánh giá chung, chúng tôi đã chế tạo thành công cảm biến sinh học sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo dựa trên công nghệ polyme phân tử nhằm phân tích định lượng kháng sinh Ciprofloxacin trong dược phẩm. Qua đó thành công bước đầu trong việc thẩm định nhanh chất lượng dược phẩm. Tuy nhiên, chúng tôi cũng đã sử dụng phương pháp đối chứng khác để phân tích định lượng CF so sánh với kết
117
quảthu được từ cảm biến do chúng tôi chế tạo. Phương pháp đối chứng chúng tôi sử dụng là phương pháp phân tích phổ hấp thụ UV-vis. Đây là phương pháp tiêu chuẩn được sử dụng hàng ngày trong nhiều phòng thí nghiệm khoa học đời sống phân tích các hóa chất và các mẫu sinh học do sự đơn giản, dễ thực hiện, đưa ra kết quả trong vài giây và vì nó là phương pháp không phá hủy, nên mẫu có thể được sử dụng cho các phân tích sau. Kết quả phân tích phổ hấp thụ UV-vis được trình bày trong phần tiếp theo.
Hình 5.27. Phổ hấp thụ UV-vis của Ciprofloxacin ở các nồng độ khác nhau.
Trên hình 5.27 trình bày đặc trưng phổ UV-vis của kháng sinh CF. Trên đặc trưng phổ xuất hiện 3 đỉnh phổ tại bước sóng 277 nm, 317 nm và 332 nm. Đây chính là những phổđặc trưng của phân tử CF. Trên bảng 5.12 trình bày giá trị bước sóng mà tại đó xuất hiện đỉnh phổ khi phân tích phổ hấp thụ UV-vis của một số kháng sinh nhóm Quinolone pha trong đệm HCl 0,1N [28].
Bảng 5.12. Bảng tổng hợp các giá trị bước sóng mà tại đó xuất hiện đỉnh phổ khi phân tích phổ hấp thụ UV-vis của một số kháng sinh nhóm Quinolone pha trong đệm HCl 0.1N [28]. Kháng sinh γ1 (nm) γ2 (nm) γ3 (nm) γ4 (nm) Ciprofloxacin (CF) - 279 317 330 Norfloxacin (NOR) 225 278 317 - Levofloxacin (LEV) 228 295 327 - Ofloxacin (OFL) 227 295 327 -
118
Tiến hành xây dựng đặc trưng chuẩn cho phân tích định lượng nồng độ kháng sinh CF bằng phương pháp phân tích phổ hấp thụ UV-vis, đường chuẩn được trình bày trên hình 5.28.
Hình 5.28. Đường đặc trưng chuẩn xác định nồng độ kháng sinh Ciprofloxacin bằng
phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ UV-VIS.
Đường đặc trưng chuẩn được xây dựng dựa trên sự phụ thuộc của cường độ phổ hấp thụ vào nồng độ kháng sinh CF của píc đặc trưng có độ hấp thụ lớn nhất (γmax = 277 nm). Kết quả cho thấy tồn tại 2 vùng tuyến tính trong khoảng nồng độ nhỏ từ 1µg/mL đến 20 µg/mL và từ 20 µg/mL đến 60 µg/mL. Điều này phù hợp với đặc tính của phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-vis là có độ chính xác cao trong dải nồng độ thấp. Sau khi xây dựng xong đường đặc t.rưng chuẩn, chúng tôi tiến hành đo quang phổ hấp thụ UV-vis của mẫu thuốc nhỏ mắt. Do giới hạn phân tích của phương pháp UV-vis, chúng tôi đã pha loãng thuốc nhỏ mắt xuống 100 và 100 lần trong HCl 0,1N.
Trên hình 5.29 trình bày quang phổ hấp thụ UV-vis của mẫu thuốc nhỏ mắt khi pha loãng. Kết quả cho thấy trên đặc trưng phổthu được các đỉnh hấp thụđặc trưng của CF tại bước sóng 277 nm (γmax), 317 nm và 332 nm. Xác định cường độ đỉnh phổγmax và so sánh với đường đặc trưng chuẩn (hình 5.28), nồng độ CF trong thuốc nhỏ mắt sau khi pha loãng 100 và 1000 lần tương ứng là 31,7 µg/mL và 3,19 µg/mL (xem bảng 5.13).
119
Hình 5.29. Quang phổ hấp thụ UV-viscủa mẫu thuốc nhỏ mắtkhi pha loãng xuống các
nồng độ khác nhau.
Như vậy phương pháp phân tích phổ đặc trưng UV-vis cho thấy nồng độ kháng sinh CF trong thuốc nhỏ mắt có giá trị nằm trong khoảng từ3,17 mg/mL đến 3,19 mg/mL cao hơn nồng độ ghi trên bao bì sản phẩm (0,3% tương đương với 3 mg/mL). Tuy nhiên, kết quả này vẫn trong giới hạn cho phép mà Bộ y tếquy định về chế phẩm thuốc nhỏ mắt có chứa kháng sinh CF là sai lệch không quá 10% so với hàm lượng ghi trên bao bì. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích sử dụng cảm biến CF-MIP/EIS. Như vậy, kết quả này một lần nữa chứng minh khảnăng phân tích định lượng của cảm biến do chúng tôi chế tạo dựa trên công nghệ polyme in phân tử với phân tích, định lượng nhanh kháng sinh CF trong dược phẩm.
Bảng 5.13. Bảng phân tích định lượng nồng độ kháng sinh CF trong mẫu thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0,3%. Pha loãng (lần) Diện tích píc (a.u.) (γmax = 277nm) Hàm lượng CF phát hiện được (µg/mL) 1000 8,18 3,19 100 54,34 31,7
5.5.3. Khảo sát hoạt động của cảm biến với đầu thu CF-MIP chế tạo theo phương pháp 2 phương pháp 2