Hình 4.14. Đường đặc trưng dòng thế của cảm biến enzyme HRP-MIP/AuNPs-SPCE với các nồng độ enzyme HRP khác nhau đo trong H2O2 1 mM (trong PBS pH 6,0).
Sau khi chế tạo cảm biến, chúng tôi tiến hành đo CV trong dung dịch PBS (pH 6,0) có chứa H2O2 nồngđộ 1 mM. Quét thế tuần hoàn từ -0,9 V đến +0,8 V vs. Ag/AgCl với tốc độquét là 10 mV/s, đường đặc trưng dòng - thếđược trình bày trên hình 4.14. Sau bước loại bỏ enzyme HRP ra khỏi màng polyme, trên đường đặc trưng dòng thế không có píc khử, chứng tỏ không xảy ra phản ứng khử của HRP với H2O2,
86
vì vậy, enzyme HRP đã được loại bỏ hoàn toàn ra khỏi mạng polyme. Khi nhỏ enzyme HRP lên bề mặt cảm biến, đường đặc trưng dòng thế của cảm biến xuất hiện píc khử tại Epc= -0.46 V. Cường độ píc khửtăng theo nồng độHRP tương ứng là 1, 10, 100 ng/mL, cho thấy sựtăng số lượng của enzyme HRP được cốđịnh trên bề mặt điện cực tại các hốc nhận diện đặc hiệu. Với kết quả trên chứng tỏchúng tôi đã chế tạo thành công cảm biến dựa trên đầu thu sinh học nhân tạo enzyme-MIP/AuNPs-SPCE nhận biết enzyme HRP.
Kết luận chương
Bốn loại cảm biến điện hóa phổ tổng trở xác định kháng nguyên ENRO sử dụng đầu thu sinh học tựnhiên và đầu thu sinh học nhân tạo xác định kháng nguyên ENRO đã được chế tạo thành công. Đối với cảm biến sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên là kháng thể ENRO, kháng thể ENRO được cố định trên điện cực AuNPs-MIP thông qua màng chemSAM của cysteamine và chemSAM của p-ATP, cảm biến với chemSAM của monome p-ATP có hệ sốxác định bội (R2) lớn hơn so với cảm biến sử dụng chemSAM của Cysteamine. Điều này hiển nhiên là do cấu trúc mạch vòng benzene của monome p-ATP nên quá trình vận chuyển điện tử xuống đếđiện cực tốt hơn. Đối với cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP, số vòng quét tạo polyme ảnh hưởng mạnh đến độ nhạy của cảm biến. Hơn nữa, cảm biến cũng cho thấy độ nhạy vượt trội so với cảm biến sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên là kháng thể ENRO. Cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo enzyme HRP-MIP để nhận biết enzyme HRP cũng đã được chế tạo và khảo sát nhằm mục đích kiểm tra chéo sự thành công của việc chế tạo cảm biến đầu thu sinh học nhân tạo MIP phát hiện kháng nguyên ENRO.
87
CHƯƠNG 5. CẢM BIẾN MIP/EIS PHÁT HIỆN KHÁNG SINH TRONG NƯỚC HỒ NUÔI THUỶ SẢN, DƯỢC PHẨM
Trong những năm gần đây, sự xuất hiện và tác động của dư lượng kháng sinh trong môi trường đối với con người và nuôi trồng thủy sản thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như xã hội. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng những chất kháng sinh này thường không bị loại bỏ trong quá trình xửlý nước thải và cũng không bị phân hủy sinh học trong môi trường. Dư lượng kháng sinh không chỉ ảnh hưởng đến cộng đồng vi sinh vật và gây ra sự kháng thuốc kháng sinh đối với vi khuẩn mà còn có thể tích tụ trong nước thải sinh học và mô của cá và gây ra những nguy cơ tiềm ẩn cho sức khỏe người tiêu dùng. Vì vậy, những tác dụng phụ do sử dụng kháng sinh đặc biệt là kháng sinh dòng fluoroquinolone rất đáng được quan tâm, đặc biệt là trong các lĩnh vực sản xuất nông nghiệp. Bên cạnh đó, sự ra đời của kháng sinh đã đánh dấu một bước tiến mạnh mẽ của ngành y học nhưng đồng thời nó cũng đem đến nhiều vấn đề đáng quan tâm. Trong đó vấn đề đang được quan tâm nhất là kháng thuốc kháng sinh. Trong đó hai nguyên nhân dẫn đến kháng thuốc kháng sinh là tình trạng sản xuất, buôn bán thuốc giả thuốc kém chất lượng và tình trạng sử dụng bừa bãi thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gây ra ô nhiễm môi trường và thực phẩm bẩn. Những vấn đề này phần lớn là do ý thức kém, mong muốn chuộc lợi của con người mà không xét đến tác động tiêu cực của nó đến cộng đồng. Để hạn chế những tình trạng này, ngoài tuyên truyền, giáo dục, răn đe cần có các phương pháp để xác định nhanh chóng, chính xác dư lượng kháng sinh trong thực phẩm cũng như hàm lượng kháng sinh trong dược phẩm. Có nhiều phương pháp có thể sử dụng để phân tích nồng độkháng sinh nhưng phần lớn các phương pháp này đều đòi hỏi thiết bịđắt tiền, quy trình phân tích phức tạp, thời gian phân tích lâu, chi phí cho mỗi lần phân tích lớn. Vì vậy, chúng tôi đã nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học phổ tổng trởđiện hóa sử dụng công nghệ polyme in dấu phân tử trên nền điện cực AuNPs-SPCE để phân tích nồng độ kháng sinh.
Các nghiên cứu trong chương này tập trung vào khảo sát hoạt động của MIP/EIS với mục tiêu xác định kháng sinh Chloramphenicol và kháng sinh dòng Fluoroquinolone (Norfloxacin, Ciprofloxacin) trong nước hồ nuôi thủy sản và trong dược phẩm. Đểtăng độ nhạy của cảm biến, bên cạnh việc pha tạp hạt nano vàng vào mạng polyme MIP, chúng tôi cũng đã tiến hành tạo màng polyme MIP trên các mầm poly(aminothiophenol) trên điện cực cảm biến. Các kết quả nghiên cứu cho thấy các cảm biến đã chế tạo có độ nhạy, độ chọn lọc cao, độ lặp lại tốt. Cảm biến cho thấy khảnăng phân tích định lượng nồng độdư lượng kháng sinh trong nước hồ nuôi thủy sản và hàm lượng kháng sinh trong dược phẩm phù hợp với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp phân tích phổ UV-vis. Hướng tới tựđộng hóa quá trình chế tạo cũng như quá trình đo đạc của cảm biến sử dụng đầu thu MIP nhằm tăng khảnăng ứng dụng thực tế các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện.
88 5.1. Cảm biến CAP-MIP/EIS
5.1.1. Đặc trưng của cảm biến CAP-MIP
Trên hình 5.1 trình bày ảnh SEM của bề mặt điện cực CAP-MIP và NIP và phổ EDS của màng CAP-MIP. Từ kết quảthu được ởảnh SEM cho thấy trên bề mặt của cảhai điện cực đều xuất hiện đốm sáng có kích thước cỡ vài chục nano mét. Khi tiến hành xác định thành phần nguyên tố hóa học bằng phương pháp EDS, kết quả cho thấy những đốm sáng đó chính là hạt nano Au. Điều này chứng tỏAu đã được khử từ hợp chất của nó ngay trong quá trình polyme hóa và pha tạp vào mạng polyme giúp cải thiện độ dẫn của màng polyme cũng như tăng cường quá trình vận chuyển điện tử đến điện cực do sự phân bố ba chiều của AuNPs trong ma trận polyme. So sánh hình thái màng trên điện cực MIP và NIP chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt. Màng polyme NIP mịn và phát triển theo xu hướng xếp chặt trong khi màng polyme MIP tơi xốp hơn và có hiện tượng bung nở trên bề mặt. Điều này chứng tỏ đã có hiện tượng in các phân tử CAP vào mạng polyme MIP và sau bước loại bỏ phân tử in ra khỏi mạng polyme trên bề mặt xuất hiện các khuôn rỗng là khuôn in đặc hiệu của phân tử chất phân tích.
Hình 5.1. Ảnh chụp SEM của bề mặt điện cực cảm biến CAP-MIP/AuNPs-SPCE và
NIP/AuNPs-SPCE cũng như phổ EDS ghi nhận được của màng CAP-MIP.
Để minh chứng rõ hơn nhận định này, chúng tôi tiến hành thực hiện phép đo quang phổ Raman sau mỗi bước trong quy trình chế tạo nhằm xác định sự có mặt hoặc vắng mặt của phân tử chất in CAP trong mạng polyme. Phổ tán xạ Raman của bề mặt điện cực CAP-MIP và NIP sau mỗi bước thực nghiệm chế tạo chỉ ra trong hình 5.2 dưới đây. Đặc trưng phổ Raman ghi nhận sự xuất hiện của các phân tử CAP trong mạng polyme tại các tần sốdao động đặc trưng (liệt kê chi tiết trong bảng 5.1) sau quá trình polyme hóa tạo màng MIP.
Bảng 5.1. Số sóng đặc trưng trong phổ Raman của phân tử kháng sinh CAP theo lý thuyết và thu được trong thực nghiệm.
TT Thực nghiệm (cm-1) Lý thuyết (cm-1) Nhóm chức
1 407 403 ν(CC)
89 3 710 711 δ(28C–Cl2); ν(CH + 27C28C) 4 820 832 ν(N-O) 5 1008 1014 δ(Ph–H); ν(Ph–H) 6 1223 1194 ν(O-H) 7 1433 1446 δ(C18C20);ν(C20H2 + C25O26) 8 1509 1508 ν(Ph–CH3)
ν: dao động kéo; δ: dao động uốn; Ph: Phenyl
Hình 5.2. Đặc trưng quang phổ Raman của bề mặt điện cực CAP-MIP và NIP tại bước
sóng kích thích là 633 nm trong 30 giây với công suất 25 mW và độ phân giải nhỏ hơn 2 cm-1.
Sau bước loại bỏ các phân tử chất in ra khỏi mạng polyme MIP, tất cả các píc đặc trưng của phân tử CAP hoàn toàn không xuất hiện trong phổRaman. Điều này chứng tỏ các phân tửCAP đã được loại bỏ khỏi mạng polyme bằng phương pháp áp thế một chiều trong dung dịch HCl 1M. Khi cho điện cực CAP-MIP tiếp xúc lại với dung dịch có chứa phân tử CAP, trên phổ Raman xuất hiện trở lại các píc đặc trưng của phân tử CAP. Điều này chứng tỏđã xảy ra hiện tượng tái liên kết các phân tử CAP trong dung dịch đo với các đầu thu sinh học nhân tạo CAP-MIP trên bề mặt điện cực cảm biến. Trên mẫu đối chứng NIP không xuất hiện bất kỳpíc đặc trưng nào của phân tử CAP ngay cảtrước và sau khi cho điện cực tiếp xúc với dung dịch chứa phân tử CAP. Kết
90
quả đo quang phổ Raman chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo CAP-MIP trên điện cực AuNPs/SPCE.
5.1.2. Hoạt động của cảm biến
Hình 5.3. a) Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến tại các nồng độ CAP từ 0 ng/mL đến 16,6
µM (đường đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các ký hiệu, đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch tương đương Randles; b) Đường chuẩn của cảm biến CAP-
MIP/AuNPs-SPCE và cảm biến đối chứng NIP.
Trên hình 5.3a trình bày đặc trưng phổ EIS khi CAP (với các nồng độ xác định từ 1 nM đến 16,6 μM) tái liên kết với đầu thu sinh học CAP-MIP. Kết quả cho thấy đường kính bán cung trong mặt phẳng Nyquist (tương đương với giá trị RCT) tăng tương ứng nồng độ CAP tăng. Sựtăng này được giải thích là do quá trình tái liên kết của các phân tử CAP với đầu thu CAP-MIP đặc hiệu của chúng đã tạo ra một lớp điện môi mỏng ngăn cản quá trình truyền điện tửđến điện cực. Giá trị RCT
được xác định thông qua khớp phổ EIS sử dụng mạch tương đương Randles. Chúng tôi tiến hành vẽđường đặc trưng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của ∆RCT (sự thay đổi giá trị RCT của cảm biến tại nồng độCAP xác định so với mẫu trắng) vào nồng độ CAP. Trên hình 5.3b trình bày đường đặc trưng của cảm biến. Đối với cảm biến NIP, giá trị RCT gần như không thay đổi theo sựtăng của nồng độ CAP. Nguyên nhân là do trên bề mặt cảm biến NIP không có các khuôn in đặc hiệu CAP-MIP, do đó không xảy ra hiện tượng các phân tử CAP tái liên kết trên bề mặt điện cực. Kết quả này khẳng định một lần nữa sựthay đổi trở kháng của cảm biến MIP hoàn toàn không do sự hấp phụ vật lý của phân tử CAP vào màng MIP. Tiến hành khớp tuyến tính đường đặc trưng chuẩn, chúng tôi xác định được giới hạn phát hiện (LOD) của cảm biến là 3,67 nM với hệ số tuyến tính cao (R2 = 0,992). Như vậy, bằng việc pha tạp AuNPs vào mạng polyme, độ nhạy của cảm biến MIP/EIS đã được cải thiện đáng kể so với nghiên cứu trước của chúng tôi.
5.1.3. Độ chọn lọc của cảm biến
Để nghiên cứu đặc tính chọn lọc của cảm biến, hai chất kháng sinh gồm thiamphenicol (có cấu trúc hóa học gần như tương tự phân tử CAP) và ciprofloxacin
91
(có cấu trúc hoá học khác hoàn toàn với CAP) đã được trộn cùng với CAP ở cùng nồng độ 66 nM. Trên hình 5.4 trình bày giá trị ∆RCTthu được khi cho cảm biến tiếp xúc với dung dịch hỗn hợp kháng sinh kể trên. Kết quả cho thấy tín hiệu thu được của cảm biến không thay đổi nhiều so với tín hiệu đo được trong dung dịch chỉ có duy nhất kháng sinh CAP. Như vậy có thể thấy tín hiệu thu được của cảm biến chính là sự tái liên kết của các phân tử chất phân tích CAP với khuôn in của chính nó. Có thể nói cảm biến đã chế tạo có độ chọn lọc cao.
Hình 5.4. Tín hiệu của cảm biến CAP-MIP/AuNPs-SPCE có pha tạp AuNPs vào màng
polyme trong môi trường chứa kháng sinh CAP nồng độ 66 µM và 66 µM của kháng sinh thử Thiophenicol và Ciprofloxacin
5.2. Cảm biến NOR-MIP/EIS
5.2.1 Đặc trưng của cảm biến NOR-MIP/EIS
Trong phần này chúng tôi khảo sát từng bước để khẳng định với quy trình trong chương 2 chúng tôi có thể chế tạo cảm biến thành công. Điều quan trọng nhất của cảm biến là tạo được màng polyme với các khuôn in đặc hiệu. Sau khi biến tính hạt vàng trên điện cực in các bon và ngâm điện cực trong p-ATP 50 mM trong 15 tiếng, điện cực được tiến hành polyme hóa với dung dịch polyme bao gồm monome p-ATP và chất cần phân tích Norfloxacin (NOR) theo phương pháp quét thế tuần hoàn với dải điện áp từ -0,2 V đến 0,6 V, tốc độ 50 mV/s trong 20 vòng. Trên hình 5.5a mô tả đặc trưng dòng-thế của quá trình điện hóa tạo mạng polyme MIP sử dụng phương pháp quét thế tuần hoàn. Kết quả cho thấy đáp ứng dòng giảm dần sau mỗi vòng quét và có sự xuất hiện rõ đỉnh oxy hóa tại điện áp +0,24 V vs Ag/AgCl do sự trùng hợp của monome p-ATP. Ở vòng đầu tiên lượng monome chưa phản ứng nhiều vì thế dòng đáp ứng lớn nhất (4,9 µA). Qua từng chu kỳ dòng đáp ứng tại đỉnh oxy hóa giảm dần điều này chứng tỏ lượng monome giảm dẫn đến độ dẫn kém đi vì thế mà
92
đỉnh oxy hóa giảm (vòng thứ2 có dòng đáp ứng 3,5 µA). Các phân tử Norfloxacin không tham gia vào quá trình trùng hợp do đó cấu trúc của chúng không bịảnh hưởng. Sau 20 vòng quét, chúng tôi quan sát bề mặt điện cực thông qua ảnh chụp bề mặt của kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Hình 5.5. a) Đặc trưng dòng-thế của quá trình in phân tử NOR vào màng
poly(aminothiophenol) theo phương pháp quét thế tuần hoàn (20 vòng quét, tốc độ 50 mV/s) và b) Ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) màng in phân tử NOR trên điện cực in các
bon biến tính hạt vàng.
Hình 5.5b thể hiện hình thái bề mặt của điện cực, ta có thể thấy trên điện cực là các đốm sáng nhỏtương đối đồng đều, chúng tôi cho rằng những đốm sáng này chính là hạt nano vàng. Tuy nhiên ta có thể thấy chúng khá mờ, chúng tôi cho rằng đã có một lớp màng mỏng bao phủtrên điện cực nên ta có thể quan sát thấy hạt vàng nhưng không thể quan sát rõ chúng. Màng này có thể tạo được trên điện cực in các bon là do chúng tôi đã tạo được lớp hạt nano vàng đồng đều trên điện cực. Như đã trình bày, phân tử p-ATP sẽ liên kết với hạt vàng thông qua liên kết S-H, sau đó với gốc NH2
hướng ra ngoài sẽ liên kết chéo với nhau để tạo ra mạng polyme. Sau 20 vòng quét, mạng polyme trên điện cực AuNPs/SPCE là một lớp màng mỏng và đồng nhất. Với độ dày rất mỏng, ta rất dễ loại bỏ phân tử Norfloxacin ra khỏi mạng tạo các khuôn in đặc hiệu với kháng sinh Norfloxacin. Kết quả cho thấy với phương pháp quét thế tuần hoàn chúng tôi có thể chế tạo thành công màng polyme trên điện cực in các bon biến tính hạt vàng.
Chúng tôi tiến hành phân tích phổ tổng trở điện hóa của từng bước ứng với quy trình chế tạo cảm biến NOR-MIP/EIS đã nêu trong chương 2. Hình 5.6 thể hiện phổ tổng trởđiện hóa của cảm biến sau từng bước chế tạo. Sau khi khớp với mạch tương đương Randles, chúng tôi xác định được giá trịđiện trở truyền điện tích RCT của từng bước. Đầu tiên chúng tôi khảo sát giá trị điện trở truyền điện tích của điện cực in các