CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
5.3. Xác định dư lượng kháng sinh Norfloxacin trong nước hồ nuôi thủy sản
sản
5.3.1. Kết quả phân tích sử dụng cảm biến NOR-MIP/EIS
Sau khi nghiên cứu khả năng hoạt động của cảm biến NOR-MIP/EIS. Chúng tôi thấy rằng cảm biến được chế tạo theo phương pháp trộn hạt keo vàng kích thước 10 nm cảm biến cho độ lặp lại, độ chọn lọc cao và có khả năng ứng dụng vào phân tích mẫu trong điều kiện thực tế. Chúng tôi tiến hành phân tích dư lượng kháng sinh trong nước hồ nuôi thủy sản theo quy trình được trình bày trên mục 2.3.1. Sau khi được xử lý và bảo quản lạnh nước từ hồ nuôi cá bớp được phân tích điện hóa. Đầu tiên cảm biến xác định Norfloxacin trên điện cực in các bon biến tính hạt vàng được chế tạo với quy trình và điều kiện như đã nghiên cứu ở mục 2.2. Sau đó chúng tôi tiến hành đo mẫu trắng và thu được giá trị điện trở truyền điện tích RCT = 0,20 kΩ. Sau đó chúng tôi nhỏ 2 µL dung dịch nước hồ nuôi đã qua xử lý lên cảm biến và đểtrong 15 phút. Sau khi được rửa bằng nước cất 2 lần điện cực được đo điện hóa và thu được giá trị RCT = 0,22 kΩ. Để kiểm chứng chúng tôi tiến hành phân tích thêm 3 mẫu nước cũng được chuẩn bị như trên. Kết quảđều cho thấy giá trị điện trở truyền điện tích đều thay đổi rất nhỏ(< 0,05 kΩ). Lấy giá trị trung bình của 3 lần phân tích trên và so sánh với đường chuẩn đã được xây dựng, kết quả cho thấy trong nước không có kháng sinh Norfloxacin. Để kiểm chứng độ thu hồi nếu như có kháng sinh trong mẫu nước chúng tôi tiến hành thêm kháng sinh chuẩn vào nước hồ nuôi và tiến hành phân tích. Chúng tôi thêm vào lượng kháng sinh chuẩn vào nước hồ nuôi và pha loãng để đạt được 4 nồng độ 0,96 ng/mL, 3,19 ng/mL, 12,76 ng/mL, 19,14 ng/mL. Hình 5.15 thể hiện đường
105
đặc trưng điện hóa của cảm biến sau khi phân tích mẫu nước được thêm kháng sinh NOR.
Hình 5.15. Đặc trưng phổ EIS của cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo xác định
kháng sinh Norfloxacin khi phân tích nước hồ nuôi.
Kết quả cho thấy giá trịđiện trở truyền điện tích đều tăng khi cho thêm kháng sinh chuẩn vào nước hồ nuôi. Điều này chứng tỏ trong điều kiện thực tế có nhiều loại kháng sinh khác nhau cũng như có nhiều thành phần sinh học phức tạp, phân tử Norfloxacin vẫn có thể tái liên kết với các khuôn in đặc hiệu của chúng. Chúng tôi tiến hành tương tự với 3 mẫu nữa và đo giá trịđiện trở truyền điện tích tương tự như mẫu trên. Kết quả giá trịđiện trở truyền điện tích là tương đương nhau với sai số nhỏ (5%). Giá trịđiện trở truyền điện tích trung bình được thay vào đường chuẩn của cảm biến đã được nghiên cứu.
Hơn nữa, chúng tôi cũng tính độ thu hồi của cảm biến khi hoạt động trong điều kiện thực tế. Độ thu hồi được thể hiện trong bảng 5.6, ta có thể thấy cảm biến hoạt động rất tốt trong điều kiện thực tế với độ thu hồi cao (> 94%).
Bảng 5.6. Kết quả phân tích mẫu nước hồ nuôi cá bớp khi thêm chất chuẩn bằng phương pháp điện hóa. Nồng độ thêm vào (ng/mL) Nồng độ tìm thấy (ng/mL) Độ thu hồi (%) 0,96 0,94 98,68 3,19 3,23 101,43 12,76 12,02 94,17 19,14 18,75 97,91
106
5.3.2. Kết quả phân tích sử dụng phương pháp HPLC
Song song với việc phân tích dư lượng kháng sinh NOR bằng cảm biến chúng tôi cũng gửi mẫy nước hồnuôi đi phân tích HPLC để kiểm nghiệm, đối chứng với cảm biến của chúng tôi. Chúng tôi tiến hành phân tích HPLC trên Viện sức khỏe nghề nghiệp và môi trường. Thông số, quy trình của phương pháp phân tích được trình bày trên chương 2.
Trên hình tại phụ lục c5.1 trình bày sắc kí đồ, xây dựng đường đặc trưng chuẩn thể hiện kết quả phân tích HPLC của kháng sinh NOR phân tán trong pha động ở các nồng độ 10, 20 30,50, 100, 150, 200 ppb. Với nồng độ 10 ppb mẫu có thời gian lưu là 4,96 phút và diện tích của đỉnh là 1145,3. Với các nồng độ tiếp theo các mẫu đều có đỉnh xấp xỉ 4,9 phút và diện tích của đỉnh tăng dần theo độtăng của nồng độ kháng sinh NOR.
Bảng 5.7. Kết quả phân tích HPLC của mẫu chuẩn NOR tại các nồng độ khác nhau.
Nồng độ (ng/mL) Diện tích đỉnh Thời gian lưu
10 1145,3 4,96 20 1675,9 4,90 30 3180,8 4,87 50 5135,7 4,83 100 11710,1 4,81 150 16862,1 4,79 200 23315,9 4,77
Giá trị diện tích đỉnh và thời gian lưu của từng nồng độđược thể hiện trong bảng 5.7.
Hình 5.16. Đường đặc trưng chuẩn của phương pháp HPLC phân tích kháng sinh
Norfloxacin trong dải nồng độ từ 10 đến 200 ppb.
107
Với kết quả trên, chúng tôi xây dựng đường chuẩn xác định kháng sinh NOR theo phương pháp HPLC (hình 5.16). Đường đặc trưng chuẩn cho thấy giá trị diện tích píc của NOR tăng tuyến tính với sựgia tăng của nồng độNOR và đạt độ tuyến tính cao R2= 0,998.
Sau khi có đường chuẩn của mẫu chuẩn chúng tôi tiến hành phân tích mẫu nước của hồ nuôi cá Bớp. Nước của hồnuôi được chuẩn bịnhư đã nêu ở chương 2. Sau khi phân tích chúng tôi thu được kết quả như hình tại phụ lục c5.2. Hình tại phụ lục c5.2a cho thấy không có kháng sinh NOR trong mẫu nước do thời gian lưu ở 4,9 phút không có đỉnh. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích của cảm biến NOR-MIP/EIS và thông tin được cung cấp từ trang trại nuôi.
Sau đó chúng tôi lần lượt thêm vào các nồng độ khác nhau của mẫu chuẩn thì đều thấy có sựthay đổi tín hiệu (hình tại phụ lục c5.1b, c, d). Kết quả thêm vào 3 nồng độ20, 40, 60 ppb đều thu được đỉnh ở gần 4,9 phút điều này phù hợp với kết quả phân tích mẫu chuẩn ở trên. Kết quả cho thấy phương pháp có khả năng phát hiện kháng sinh NOR trong điều kiện thực. Tuy nhiên từ diện tích của đỉnh chúng tôi tính độ thu hồi của phương pháp này thì cho thấy độ thu hồi (được thể hiện trong bảng 5.8) không cao như phương pháp phân tích điện hóa. Tại nồng độ thêm 40 ppb mẫu chuẩn độ thu hồi đạt 90,6% tuy nhiên với thêm nồng độ20 ppb độ thu hồi chỉ đạt 82,8% (bảng 5.8). Kết quả cho thấy, qua các phương pháp phân tích và đối chiếu, chúng tôi khẳng định đã chế tạo thành công cảm biến sinh học sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo NOR-MIP nhằm phân tích định lượng kháng sinh Norfloxacin trong nước hồ nuôi thủy sản. Qua đó kiểm soát tình trạng sử dụng tràn lan thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gây những tác hại không tốt đến môi trường và sức khỏe người tiêu dùng.
Bảng 5.8. Kết quả phân tích mẫu nước hồ nuôi cá bớp sử dụng phương pháp HPLC.
Mẫu Thời gian sống
(phút) Diện tích đỉnh Phát hiện (ng/mL)
Độ thu hồi (%)
Mẫu nước (M) Không phát hiện
M +20 ppb 4,751 1537,3 15,552 82,8 M +40 ppb 4,721 3855,9 36,255 90,6 M +60 ppb 4,719 5743,0 52,290 87,2