Do những đặc tính thú vị mà MIP đã thu hút sựchú ý ngày càng tăng của các nhà nghiên cứu thông qua sốlượng các bài báo tăng hàng năm (xem Hình 1.10) [125].
Hình 1.10. Số lượng bài báo trong các lĩnh vực Cảm biến sinh học MIP, Công nghệ MIP và
Cảm biến sinh học.
Kỹ thuật in dấu phân tử (MIP) được báo cáo lần đầu tiên bởi Wulff và Sarhan trong công trình của họ xuất bản năm 1972 [126], trong đó họ đã mô tả việc tổng hợp polyme chức năng (monome chức năng) gắn với các phân tử đường (được gọi là phân tử khuôn mẫu) trong dung dịch thích hợp. Sau quá trình tổng hợp, bằng cách rửa đơn giản, các phân tửđường bị mắc kẹt trong nền polyme được loại bỏ và hình
22
thành các khuôn in của phân tửđường trong mạng polyme. Kể từ khi công trình này được công bố, công nghệ polyme in dấu phân tử(MIP) đã đóng một vai trò nổi bật như một công cụ phân tích trong sự phát triển của các cảm biến được thiết kế riêng cho từng loại chất phân tích.
Hình 1.11. Số lượng các bài báo công bố về sự phát triển của cảm biến điện hóa MIP dựa
trên vật liệu ống nano cacbon và graphene trong 8 năm qua.
Trong số các công trình công bốliên quan đến ứng dụng MIP trong cảm biến, điển hình là công bố của Arshady và Mosbach [127], họ đã công bố một quy trình đơn giản về tổng hợp polyme tùy chỉnh được dựa trên các tương tác bổ sung. Các cảm biến trên cơ sở MIP này thể hiện đầy đủ các đặc tính bao gồm độ chọn lọc cao, độ nhạy, độ tin cậy cao, chi phí thấp và ổn định cơ học, nhiệt và hóa học [128], ngoài ra còn được sử dụng như các thụ thể sinh học tự nhiên (kháng nguyên và kháng thể). Sự hình thành MIP nói chung dựa trên sự trùng hợp của một hoặc nhiều monome chức năng với trình tự liên kết chéo mà polyme hóa khi có mặt phân tử đích (thường là phân tử cần phát hiện, còn được gọi là khuôn mẫu) thông qua cộng hóa trị hoặc không tương tác cộng hóa trị. Sau khi trùng hợp, phân tử chất in được tách ra khỏi mạng polyme. Việc loại bỏ phân tử dẫn đến việc tạo ra các lỗ hổng trong cấu trúc với kích thước, hình dạng và sựtương tác bổ sung cho khuôn mẫu có thể xoay quanh một cách thuận nghịch và có tính chọn lọc cao ngay cả khi có mặt của chấ nhiễu nền khác [129]. MIP cũng có thể được điều chế bằng cơ chế trùng hợp khối lượng lớn bằng quang, sol-gel và các cơ chế trùng hợp ghép bề mặt. Nói chung, thời gian đáp của các cảm biến dựa trên MIP dài hơn vì những khó khăn liên quan đến sự khuếch tán. Thời gian phản ứng ngắn nhất có liên quan đến quá trình trùng hợp ghép [130], [131]. Độ nhạy và hiệu quả của cảm biến dựa trên MIP có liên quan trực tiếp đến sốlượng
23
các khuôn in có trên bề mặt cảm biến. Thật vậy, MIP được hình thành trong điện cực phẳng phải chịu một số trở ngại như trùng hợp không đều, tính di động bị hạn chế và sự chật chội của các khoang, có xu hướng làm giảm tính chọn lọc của chúng do khả năng tiếp cận kém, gây ra tín hiệu điện hóa thấp [132], [133]. Tuy nhiên, việc hình thành các bề mặt có cấu trúc nano dường như là một cách đầy hứa hẹn để khắc phục những vấn đề này thông qua việc cải thiện độ nhạy và độ chọn lọc của các cảm biến này. Kể từ năm 2010 (xem hình 1.11), đã có sự gia tăng đều đặn về các bài báo sử dụng vật liệu nano các bon bao gồm ống nano các bon và graphene làm vật liệu đế phát triển màng MIP ứng dụng trong cảm biến sinh học.
Hình 1.12. Cảm biến đo màu vàng sunset trong mẫu thực phẩm bằng cách sử dụng cảm biến điện hóa được cấu tạo bằng cách điện hóa polyme acrylamide và N, N-methylene- bisacrylamide vào các ống nano carbon đa vách được chức năng hóa trên điện cực carbon (f-
MWCNTs-GCE) [134].
Arvand và cộng sự [134], Yin và cộng sự [137] đã phát triển một cảm biến đo màu vàng sunset (SY) thông qua quá trình trùng hợp điện hóa của acrylamide và dopamine trên nền điện cực các bon (GCE) được chức năng hóa với ống các bon đa vách (MWCNT). Sơ đồ quy trình chế tạo được mô tả trong hình 1.12 Anirudhan và Alexander [135] đã sử dụng MWCNT được chức năng hóa trong axit nitric (MWCNT-COOH) để phát triển một cảm biến đo hemoglobin có tính chọn lọc dựa trên axit itaconic. MWCNT-COOH phản ứng cộng hóa trị với epichlorohydrin để tạo thành MWCNT bị epoxy hóa và vòng epoxit của MWCNT phản ứng với rượu allyl khi có mặt kim loại natri để tạo thành MWCNT vinyl hóa (MWCNTCH]CH2). Phản
24
ứng trùng hợp được thực hiện giữa nhóm vinyl và axit itaconic đơn chức với Hb là phân tử mẫu. Các đặc tính bề mặt của cảm biến được xác định bằng chụp ảnh hiển vi điện tử quét SEM, hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), nhiễu xạ tia X (XRD) và quang phổ Raman. Công trình của họ cho thấy cảm biến có độ nhạy rất tốt đối với DNT, SY và hemoglobin. Nguyên nhân có thể là do diện tích bề mặt riêng lớn và hoạt động điện xúc tác tuyệt vời của MWCNTs bên cạnh các hốc nhận biết MIP nằm trong màng polyme MIP. Wang và cộng sự [136] đã biến tính GCE bằng ống nano các bon đơn vách để hình thành MIP sử dụng ATO và silica làm monome và norepinephrine làm phân tửđích. Hỗn hợp ATO-silica với norepinephrine được nhỏ giọt và hấp phụ trên bề mặt của điện cực SWNTs-GCE và làm khô ở nhiệt độ phòng. Hình ảnh SEM cho thấy bề mặt biến tính SWCNT thô hơn bề mặt khi chưa biến tính. Chính sự có mặt của cấu trúc hình ống có thểlàm tăng vị trí liên kết của các phân tử khuôn. Bên cạnh đó, SWNTs -GCE thúc đẩy việc chuyển các phân tử sinh học và điện tửtrên điện cực, làm tăng thêm tín hiệu điện hóa và độ nhạy của cảm biến.
Vì graphene (GR) không hòa tan trong nước nên việc biến tính nó để chế tạo cảm biến MIP là vô cùng quan trọng. Wang và cộng sự, [138] đã sử dụng poly (diallyldimetylamoni clorua) để chức năng hóa GR thông qua tương tác π-π trong việc xác định 4-clorophenol. Alizadeh và cộng sự [139] đã sử dụng một lượng nhỏ GR trộn với than chì để tổng hợp MIP. Trong nghiên cứu này, hai loại monome chức năng đã được sử dụng: axit metacrylic và vinyl benzen để tạo ra polyme in dấu fluoxetin. Axit metacrylic cung cấp các tương tác dựa trên liên kết và tiếp cận fluoxetin thông qua các trung tâm amin thứ cấp và flo của phân tử đích. VB tương tác trong phức chất thông qua tương tác π-π với vòng benzen của fluoxetin. Phương pháp này đã làm tăng đáng kể độ nhạy của điện cực để xác định fluoxetin, trong đó LOD là 5,0 nM thu được. Zhu và cộng sự [140] đã sử dụng hai loại chất lỏng ion (IL) trong tổng hợp MIP (1-vinyl-3-butylimidazolium tetrafluoroborate làm đơn phân và 1,4-butanediyl-3,3'-bis-l-vinylimidazolium dibromide làm chất liên kết chéo). ILs có các đặc tính tuyệt vời thích hợp để biến tính bề mặt điện cực. Trong số các đặc tính này bao gồm độ dẫn ion tốt, độổn định nhiệt cao, áp suất hơi thấp và khảnăng hòa tan nhiều hóa chất, chẳng hạn như GR. Màng tổng hợp MIPs-ILs-GR, cung cấp sự che chắn giữa các tương tác π-π của các tấm GR và thúc đẩy sự phân tán của chúng, được sử dụng để xác định metyl parathion (MP), losartan và 6-benzylaminopurin tương ứng, thể hiện LOD của nM với độ chọn lọc và độ ổn định cao. dấu phân tử. Cảm biến có độ nhạy cao đểxác định chlorpyrifos và chlordiazepoxide, cho thấy độ lặp lại tốt và ổn định.
Các nghiên cứu trong nước về cảm biến điện hóa đang được triển khai tại một số nhóm. Điển hình là Nhóm nghiên cứu của Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là một nhóm nghiên cứu đi đầu trong lĩnh vực cảm biến sinh học với nhiều đề tài tập trung vào các hướng như cấu trúc polyme nano ứng dụng trong cảm biến miễn dịch, vi cảm biến sinh học điện hoá để xác định nhanh độc tố aflatoxin trong sữa. Nhóm nghiên cứu của PGS.
25
TS Nguyễn Xuân Viết của trường Đại học Quốc gia Hà Nội phát triển cảm biến điện hóa phát hiện glucose và một số dấu ấn sinh học sử dụng điện cực mực in các bon biến tính bằng các vật liệu cấu trúc nano. Nhóm nghiên cứu của PGS. TS Mai Anh Tuấn cũng đã phát triển cảm biến ISFET kết hợp công nghệ polyme in phân tử (polypyrrole và polyaniline) phát hiện kháng sinh Chloraphenicol. Tuy nhiên, cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở hiện đang có nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã và đang triển khai nhiều nghiên cứu ứng dụng cảm biến sinh học trong y tế (chẩn đoán bệnh sớm) và môi trường (an toàn thực phẩm). Nhóm nghiên cứu tập trung phát triển các phương pháp cho phép cố định được các thành phần sinh học (enzyme, kháng nguyên-kháng thể, DNA, aptamer, protein...) lên bề mặt điện cực rắn (điện cực in lưới, vi điện cực, linh kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM) với hiệu suất cao mà không làm giảm hoặc mất hoạt tính sinh học của chúng. Nhóm cũng đã phát triển được cảm biến SWCNTFET ứng dụng chẩn đoán sớm ung thư.
Kết luận chương
Trong chương này chúng tôi đã tổng quan một số lý thuyết cơ bản về: i) Cảm biến sinh học điện hoá;
ii) Công nghệ polyme in phân tửđể chế tạo đầu thu sinh học;
iii) Một số kỹ thuật phân tích được sử dụng trong luận án bao gồm phân tích phổ Raman, phân tích phổ UV-vis, phân tích phổ HPLC.
Trong quá trình tổng quan tài liệu chúng tôi nhận thấy tồn tại nổi cộm nhất là trong công nghệ MIP màng. Có hai nhược điểm lớn nhất cần phải được khắc phục. Thứ nhất đó chính là tính không đồng nhất của các vị trí liên kết có thểgây ra tương tác không đặc hiệu và do đó làm giảm chất lượng của tín hiệu. Thứ hai, tính chất ngẫu nhiên của quá trình polyme hóa cũng có thểảnh hưởng đến tính đồng nhất trong việc phân bố các khuôn in trong mạng polyme, gây ra sự biến thiên không mong muốn trong khuếch tán. Giải pháp chúng tôi đưa raởđây là sử dụng công nghệnano để cải tiến công nghệ MIP. Vì thế, các nghiên cứu tiếp theo của luận án sẽ tập trung vào việc phát triển cảm biến MIP trên nền điện cực thương mại rẻ tiền được biến tính bởi lớp hạt nano vàng phân tán đều trên bề mặt cũng như đưa ra được kỹ thuật nhúng hạt nano vàng vào mạng polyme MIP để cải thiện độ dẫn của chúng.
26
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trong chương này tác giảtrình bày phương pháp thực nghiệm để chế tạo cảm biến sinh học phát hiện các phân tử nhỏ sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo và các phương pháp nghiên cứu. Đầu thu sinh học nhân tạo được tổng hợp theo công nghệ polyme in phân tử (MIP). Công nghệ MIP cho phép thiết kế và chế tạo các đầu thu sinh học nhân tạo có tính chọn lọc và độ đặc hiệu được xác định trước, ứng dụng trong các lĩnh vực phân tách, phân tích, xúc tác, hay cảm biến sinh hóa. MIP sử dụng ma trận polyme kết hợp giữa chất cần phân tích và các gốc monomer hóa. Sau khi loại bỏ các chất phân tích (được gọi là khuôn mẫu) trên màng polyme sẽ xuất hiện các khuôn nhận dạng phân tử rất mạnh. Tại một số vị trí của khuôn có đính các liên kết có tính chọn lọc tương tựnhư đầu thu sinh học tựnhiên như kháng nguyên, kháng thể hoặc enzyme. Độ chọn lọc của phương pháp khá cao do dựa vào các yếu tố hình dạng, kích thước và các nhóm chức hóa học của chất cần phân tích. Chính vì vậy, phương pháp này không chỉ có thể nhận diện các chất sinh học mà còn đặc biệt hữu ích với các chất hóa học. Các đầu thu sinh học nhân tạo MIP có độ bền và độổn định cao hơn so với các đầu thu sinh học tự nhiên trong các môi trường khắc nghiệt như độ pH cao, áp suất cao hay nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp. Đầu thu MIP cũng có thể sử dụng được trong nhiều tháng mà không có tổn thất về hiệu quả sử dụng cũng như yêu cầu bảo quản đơn giản hơn so với đầu thu sinh học tựnhiên. Đầu thu sinh học nhân tạo MIP được tổng hợp trên điện cực mực in các bon SPCE (screen-printed carbon ink electrode) phủ lớp hạt nano vàng (AuNPs) phân tán đều trên bề mặt. Điện cực SPCE chế tạo theo công nghệin lưới màng dày với mực in là các bon có kích thước nhỏ (cỡ micro mét) trộn với chất kết dính. Điện cực SPCE có giá thành rẻ, linh hoạt trong thiết kế và dễ dàng tích hợp với thiết bịđo cầm tay.
Tín hiệu của cảm biến được xác định bằng phương pháp đo phổ trở kháng phức (electrochemical impedance spectroscopy - EIS). Các phương pháp như chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM), phổ tán xạnăng lượng tia X (EDS) và phổ tán xạ Raman, được sử dụng để khảo sát hình thái cấu trúc và đặc tính của đầu thu MIP đã tổng hợp. Các phép đo sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và quang phổ hấp thụ (UV-vis) được sử dụng như một phương pháp đo kiểm chứng hoạt động của cảm biến MIP/EIS.