CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Quy trình công nghệ chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo MIP
2.2.4. Tạo màng polymeMIP
Dung dịch tạo màng polyme được pha trong dung dịch đệm 100 mM KCl/ 50 mM PBS chứa 12 mM p-ATP và chất in ở nồng độ xác định. 35 µL dung dịch này được nhỏ lên bao trùm cả 3 điện cực. Tiến hành quét thế tuần hoàn trong dải điện áp từ - 200 mV to +600 mV vs. Ag/AgCl với tốc độ quét là 50 mV/s với số vòng quét xác định. Màng polyme in phân tử hình thành một cách từ từ trên bề mặt điện cực và đạt được độ dày màng phù hợp phụ thuộc vào số vòng quét. Màng polyme được hình thành thông qua liên kết polyme liên hợp của cặp electron của nguyên tửnitơ của phân tử p-ATP, tạo thành chuỗi poly (p-ATP) có cấu trúc xen kẽ giữa vòng phenyl và nhóm chức chứa gốc nito. Trong môi trường có độ pH 6,86, các nguyên tử N sẽ bị proton hóa ở một mức độ nhất định tạo ra các hạt mang điện hình thành trong ma trận polyme giúp cho màng MIP có tính dẫn điện. Trong quá trình trùng hợp các phân tử chất in sẽ liên kết với các phân tử p-ATP trong chuỗi polyme thông qua liên kết hidro giữa nguyên tử O/N với nguyên tử H (giữa nguyên tử O của chất in với H của nhóm NH của p-ATP, giữa nguyên tử H của nhóm OH với nguyên tử N của p-ATP, giữa H và N của phân tử chất in hoặc p-ATP). Tỉ lệ giữa phân tử chất in và nồng độ monome p-ATP sẽ ảnh hưởng tới số liên kết được tạo thành giữa chất in và màng, đồng thời cũng ảnh hưởng đến sốlượng khuôn in hiệu dụng được hình thành và độổn định của màng polyme trên bề mặt điện cực. Tỉ lệ nồng độ giữa monome và phân tử chất in thường được chọn trong khoảng 3:1 đến 6:1 để màng polyme MIP được tổng hợp tốt nhất. Trong nghiên cứu này, tỉ lệ giữa monome p-ATP và phân tử chất in tối ưuđược lựa chọn là 4:1 dựa trên đặc điểm kích thước và cấu tạo của phân tử chất in.
Một loạt phân tử nhỏđược lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu chế tạo cảm biến có độ nhạy, độ chọn lọc và giới hạn phát hiện phù hợp ứng dụng chẩn đoán. Các phân tử nhỏđược lựa chọn từ ba nhóm: protein, kháng nguyên và kháng sinh. Do công nghệ MIP nhận diện phân tử dựa vào các yếu tố hình dạng, kích thước và các nhóm chức hóa học của chất cần phân tích. Cho nên, các loại phân tử nhỏđược lựa chọn làm chất
31
phân tích là có chủđích. Trong nhóm protein, sarcosine và 17β-estradiol (E2) được lựa chọn do chúng có đặc điểm cấu trúc hóa học hoàn toàn khác biệt.
Enrofloxacin (ENRO) được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh truyền nhiễm vì hoạt tính phổ rộng của nó và điều này có thể dẫn đến tồn dư ENRO tồn tại trong cơ thểđộng vật, do đó có thể dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc hoặc dịứng trong động vật. Do vậy, cần thiết phải có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong thú y cảtrong điều trị cũng như dựphòng và cũng cần phải có các phương pháp sàng lọc nhanh và nhạy để phát hiện dư lượng kháng sinh này. Phương pháp sàng lọc phổ biến hiện nay là phương pháp thông qua phản ứng miễn dịch kháng nguyên-kháng thể, sử dụng kháng thểđể phát hiện kháng nguyên. Do đó, kháng nguyên ENRO được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu.
Thuốc kháng sinh đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị động vật bị bệnh, đặc biệt tại các thủy hải sản. Do lo ngại vềdư lượng thuốc xâm nhập vào chuỗi thức ăn và góp phần vào sự kháng thuốc của vi khuẩn, giới hạn dư lượng tối đa (MRL) đã được thiết lập cho một sốdòng kháng sinh như phenicol và fluoroquinolon. Do đó, chúng tôi đã lựa chọn phân tử kháng sinh chloramphenicol, ciprofloxacin và norfloxacin làm đối tượng nghiên cứu. Hình 2.3 trình bày cấu trúc hóa học của các phân tử chất phân tích đã được lựa chọn trong nghiên cứu.
Hình 2.3. Cấu trúc hóa học của các chất phân tích lựa chọn trong nghiên cứu.
Do đặc điểm của công nghệ MIP và đặc điểm về cấu trúc hóa học của các chất phân tích, đểđạt được cảm biến có độ nhạy và chọn lọc cao, một số kỹ thuật đã được sử dụng thêm trong bước tổng hợp màng polyme MIP. Chi tiết của các kỹ thuật đó được mô tả chi tiết tiếp theo đây.