Tính chọn lọc của cảm biến

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của các phân tử sarcosine, alanine, lysine và cysteamine.

Hình 3.10 là cấu trúc hóa học của Sarcosine, Alanine, Lysine, Cysteamine. Các hợp chất này có cấu trúc hóa học tương tựSarcosine. Để nghiên tính lọc lựa của cảm biến, các hợp chất hoá học có cấu trúc hoá học và dạng tương tự với Sarcosine đã được sử dụng để phát hiện cùng với sarcosine.

Hình 3.11 biểu diễn các tín hiệu trở kháng phức thu được khi cho cảm biến MIP đã được chế tạo, hoạt động trong các dung dịch có chứa các nồng độ khác nhau của sarcosine, alanine và lysine trong dải đo từ 1 ng/mL đến 1.6 µg/mL. So sánh với

67

đường cong chuẩn hoá của sarcosine, sựthay đổi của giá trị tangent của đường tuyến tính 𝑅𝑅𝐶𝐶𝐶𝐶 với các chất Alanine và Lysine khá nhỏ, lần lượt là 0,115 và 0,120 so với 0,400 của Sarcosine. Tại mỗi điểm nồng độ, cường độ tín hiệu thay đổi của Alanine và Lysine nhỏ hơn gần 3 lần so với của Sarcosine. Kết quả này cho thấy cảm biến MIP để phát hiện Sarcosine đã được chế tạo có độ chọn lọc khá tốt khi được sử dụng đểđo các chất có cấu trúc và các nhóm chức hóa học gần tương tự như Sarcosine. Ngoài ra, tính chất độ dày kích thước nano của màng polyme cũng được xác nhận lại bằng cách cho cảm biến đã được chế tạo hoạt động trong dải nồng độ từ 1 ng/mL đến 1,6 µg/mL của hợp chất hoá học thiolate cysteamine. Đây là một hợp chất có kích thước tương tự sarcosine, một đầu có chứa nhóm chức -NH2 tượng tự sarconsine đầu còn lại thay vì chứa nhóm -COOH mà lại chứa nhóm chức -SH có khảnăng tương tác với các phân tử hạt vàng tự do. Từ kết quảđo thu được, ta nhận thấy rằng tín hiệu của cảm biến khi phát hiện cysteamine khá cao gần bằng ½ tín hiệu của sarcosine. Điều này có thể giải thích do cấu trúc của cysteamine có chứa nhóm chức -SH đã có một tỉ lệ nhất định tương tác với các phân tử hạt vàng. Tỉ lệ này có thểliên quan đến độ xốp của màng và khảnăng loại bỏ các phân tử mẫu nằm sâu trong màng gần bề mặt các hạt vàng khi sử dụng phương pháp rửa điện hoá sử dụng điện thếtĩnh kết hợp với dung dịch HCl. Các kết quả này cho thấy rằng cảm biến sarcosine-MIP đã chế tạo có độ chọn lọc và tính đặc hiệu đáng kể trong việc phát hiện các phân tử sarcosine.

Hình 3.11. Độ chọn lọc của cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE với các chất phân tích khác nhau có cấu trúc và tính chất gần như Sarcosine.

68 3.2. Cảm biến 17β-estradiol (E2)

3.2.1. Khảo sát hình thái màng E2-MIP bằng phương pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) điện tử quét (SEM)

Để nghiên cứu ảnh hưởng của đế đối với sự phát triển của màng polyme MIP và độ nhạy của cảm biến E2- MIP, hai loại điện cực là SPAuE và SPCE biến tính AuNPs đã được sử dụng. Màng NIP được tạo thành trên điện cực AuNPs-SPCE. Sau 20 vòng quét mạđiện và loại bỏ phân tử chất in, có thể dễ dàng nhìn thấy sự khác biệt lớn về hình thái của E2-MIP/ SPAuE và E2-MIP/AuNPs-SPCE trong ảnh SEM (hình 3.12).

Hình 3.12. Ảnh SEM của E2-MIPs tạo thành trên SPAuE và AuNPs-SPCE, cũng như màng NIP tạo thành AuNPs-SPCE

Các hạt p-ATP được hình thành ở kích thước micromet trên đế SPAuE trong khi polyme phủ một lớp mỏng trên đế AuNPs-SPCE. Ngoài ra, ảnh SEM cho thấy có những điểm sáng xuất hiện trên cả hai điện cực E2-(MIP-Au)composite/AuNPs- SPCE và (NIP-Au)composite/AuNPs-SPCE với kích thước hàng chục nanomet. Sau khi phân tích các thành phần hóa học của màng MIP trên SPCE bằng phương pháp EDS, chúng tôi nhận thấy những điểm sáng đó là các hạt Au. Điều này chứng tỏ rằng Au đã bị khử từ thành phần của nó trong quá trình trùng hợp và được nhúng vào nền polyme trong quá trình trùng hợp. Chúng tôi cũng tìm thấy sự khác biệt trong các mẫu màng của điện cực MIP và NIP: màng polyme NIP mịn hơn và sắp xếp chặt chẽhơn trong khi MIP mềm hơn và có xu hướng mở rộng trên bề mặt của nó. Phát hiện này cho thấy rằng trong quá trình thí nghiệm, các phân tửE2 đã được in lên màng polyme và sau khi loại bỏ các phân tử đó, trên bề mặt tồn tại các lỗ trống đóng vai trò là nơi có thểcư trú của các phân tửđược phân tích.

3.2.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến E2-MIP/EIS

Tương tự cảm biến sarcosine-MIP, các phép đo trở kháng faradaic được tiến hành đểđánh giá hoạt động của các cảm biến E2-MIP. Các cảm biến được chế tạo bao gồm E2-MIP/AuNPs-SPCE, E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE và (NIP- Au)composite/AuNPs-SPCE được tiếp xúc với nồng độ E2 khác nhau, từ 10 fM đến 100 nM.

69

Hình 3.13. Biểu đồ Nyquist cho các phép đo trở kháng faradaic tương ứng với E2 (ở các nồng độ khác nhau từ 1 fM đến 100 nM) đối với a) E2-MIP/AuNPs-SPCE, b) E2-(MIP- Au)composite/AuNPs-SPCE, c) Đường cong đáp ứng (NIP-Au)composite/AuNPs-SPCE và

(d) thu được bằng cách vẽ biểu đồ ΔRCT theo hàm logarit của nồng độ E2 cho cảm biến sinh học dựa trên E2-MIP được chế tạo

Hình 3.13a-c cho thấy đồ thị Nyquist của phổ trở kháng của các cảm biến dựa trên MIP và dựa trên NIP trước và sau khi liên kết E2. Đường kính của hình bán nguyệt Nyquist, tương ứng với điện trở truyền điện tử RCT, tăng một cách có hệ thống khi tăng nồng độE2 đối với các cảm biến E2-MIP/AuNPs-SPCE và E2-(MIP- Au)composite/ AuNPs-SPCE. Đây là kết quả của sự liên kết của các phân tử E2 với các hốc nhận biết. Do đó, sự hình thành lớp phân tử E2 cản trở sự truyền điện tử giữa các mặt và xảy ra sựgia tăng điện trở truyền điện tử. Ngược lại, trong trường hợp cảm biến dựa trên NIP, sựgia tăng là nhỏ không đáng kể. Lý do chính sự gia tăng này là không đầu thu MIP của E2 trên bề mặt của cảm biến NIP, do đó không xảy ra sự liên kết lại của các phân tử E2. Kết quả này nhấn mạnh kết luận của chúng tôi rằng sự khác biệt trở kháng của cảm biến dựa trên MIP không liên quan đến sự hấp thụ vật lý của các phân tử E2 vào màng MIP.

70

Các đường đặc trưng chuẩn của cảm biến được biểu diễn qua sựgia tăng của RCT

như là một hàm của lôgarit nồng độ E2 (Hình 3.13d) cho cả cảm biến dựa trên E2- MIP và NIP. Phạm vi tuyến tính trong biểu diễn lin-log này trải dài hơn 7 bậc độ lớn (từ 10 fM đến 100 nM). Ngoài ra, sự thay đổi RCT của cảm biến E2-(MIP- Au)composite/AuNPs-SPCE lớn hơn E2-MIP/AuNPs-SPCE (3 lần). Điều này khẳng định rằng việc pha tạp hạt nano Au vào mạng polyme dẫn đến cải thiện độ nhạy của cảm biến do tăng cường truyền điện tửđến điện cực cảm biến. Đường chuẩn của cảm biến E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE được mô tả theo công thức thực nghiệm sau: ΔRCT (kΩ) = 34 + 2,2 * C (mol/L). Hệ số R2 = 0,993, cho thấy hệ số tuyến tính cao. Dựa trên đường chuẩn ở trên, giới hạn phát hiện (LOD) của cảm biến này đối với E2 trong chất lỏng được xác định là 2 fM với diện tích điện cực nhạy là 2,64 mm2. Sựthay đổi của RCT là rất nhỏđối với NIP. Điều này khẳng định rằng sựthay đổi của RCT là do liên kết E2 với khuôn nhận diện đặc hiệu của nó, tức là đầu thu sinh học MIP, chứ không phải do bất kỳ sự hấp thụ vật lý nào.

3.2.3. Khảo sát đặc tính chọn lọc của cảm biến E2-MIP

Các phép đo tham chiếu cũng được thực hiện với estriol, testosterone, stigmasterol và cholesterol đểđánh giá tính chọn lọc của cảm biến E2-MIP đã chế tạo. Lý do lựa chọn các phân tử này vì chúng có cấu trúc phân tử và trọng lượng rất tương tự với E2 nên chúng rất lý tưởng cho một thử nghiệm chọn lọc chéo nghiêm ngặt. Như đã thấy trên hình 3.14, cảm biến E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE có tín hiệu cao hơn hẳn khi tiếp xúc với E2 so với các phân tửkhác. Điều này cho thấy cảm biến có độ chọn lọc cao.

Hình 3.14. Tính chọn lọc của cảm biến sinh học dựa trên MIP được chế tạo cho các chất phân tích khác nhau.

71

Kết luận chương

Hai loại cảm biến sarcosine-MIP/EIS và E2-MIP/EIS đã được chế tạo thành công bằng công nghệ polyme in phân tử. Các nghiên cứu cho thấy hiệu quả của việc sử dụng điện cực SPCE biến tính lớp hạt nano vàng (AuNPs). Lớp AuNPs trên điện cực SPCE đã làm tăng diện tích hiệu dụng bề mặt điện cực dẫn đến làm tăng sốlượng các phân tửsarcosine và E2 in được vào màng polyme. Hơn nữa, lớp AuNPs đã tạo ra được lớp SAM định hướng trên bề mặt điện cực làm cho màng polyme MIP được tạo ra mỏng và có độđồng đều cao, thuận lợi cho quá trình tách phân tử Sarcosine và E2 ra khỏi mạng polyme MIP, hình thành khuôn nhận dạng sinh học đặc hiệu. Hiệu suất hình thành đầu thu MIP được cải thiện đáng kể thông qua việc khảo sát độ nhạy và giới hạn phát hiện của cảm biến. Việc nhúng thêm hạt nano vàng vào mạng polyme bằng cách khử ion Au ra khỏi hợp chất ngay trong quá trình polyme đã làm tăng đáng kểđộ dẫn của màng polyme dẫn tới làm tăng độ nhạy của cảm biến. Từđường đặc trưng chuẩn của cảm biến đã cho thấy khảnăng đáp ứng yêu cầu sử dụng cảm biến trong việc đo đạc các mẫu thực.

72

CHƯƠNG 4. CẢM BIẾN MIP/EIS PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN

ENROFLOXACIN

Nhiều loại kháng sinh đã được sử dụng đểđiều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm trùng do vi khuẩn ở động vật sản xuất thực phẩm. Việc sử dụng kháng sinh có thể kiểm soát hiệu quả sự xuất hiện của dịch bệnh và duy trì sự phát triển của vật nuôi. Enrofloxacin (ENRO), một loại kháng sinh kháng khuẩn nhóm fluoroquinolon, có phổ hoạt động rộng chống lại hầu hết các mầm bệnh Gram âm, bao gồm Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae và một số vi khuẩn Gram dương. Nó thường được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng tiết niệu, phổi và tiêu hóa trong thú y do thời gian bán hủy dài và phân bố rộng khắp các mô khác nhau. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 1998, enrofloxacin là kháng sinh được chấp thuận rộng rãi nhất thuộc họfluoroquinolones được cho gia súc, gia cầm, cá hoặc động vật nuôi trên toàn cầu. Tuy nhiên, với việc ngày càng sử dụng nhiều kháng sinh enrofloxacin, các vấn đề vệ sinh, bao gồm dư lượng thuốc trong mô ăn được của động vật sản xuất thực phẩm và sự kháng thuốc của vi khuẩn được truyền từđộng vật sang người, đã xảy ra đáng kể. Để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng,Liên minh Châu Âu đã thiết lập giới hạn dư lượng tối đa (MRL) đối với enrofloxacin là ở 100 g trên 1 kg trong thịt động vật. Hơn nữa, Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã rút lại sự chấp thuận cho việc sử dụng enrofloxacin cho gia cầm vào năm 2005, vì dữ liệu khoa học đã chỉ ra rằng việc sử dụng enrofloxacin gây ra sựđề kháng CampyLOBacter, có thể dẫn đến việc điều trị bệnh ởngười không hiệu quả. Do đó, việc phát triển các phương pháp chính xác, cụ thể và thuận tiện để phát hiện enrofloxacin trong lĩnh vực thú y và y tếđã trở thành một vấn đề quan trọng.

Cho đến nay, đã có nhiều phương pháp được phát triển để phát hiện định lượng enrofloxacin. Các phương pháp đó bao gồm: von-ampe hòa tan hấp phụ, phép đo quang phổ, mao quản điện di với máy dò dãy diode hoặc khối phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng hấp phụ tia cực tím hoặc phát hiện huỳnh quang, và xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) với phép đo phổ UV-vis hoặc huỳnh quang. Trong sốcác phương pháp đó thì phương pháp ELISA sử dụng phép đo huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao để phát hiện enrofloxacin thông qua tương tác kháng nguyên kháng thể. Độ nhạy của phương pháp này đạt đến 0,1 ng/mL. Tuy nhiên phương pháp này có quy trình phức tạp do phải tiến hành gắn nhãn cho kháng nguyên hoặc kháng, thể bằng enzyme và qua đó xác định tương tác của enzyme đó với các thụ thể cụ thể. Phương pháp đo trở kháng phức (EIS) có một sốưu điểm hơn phương pháp ELISA như không yêu cầu bước gắn nhãn, cho phép đo theo thời gian thực nên đã được áp dụng rộng rãi để phát hiện kháng nguyên thông qua tương tác kháng nguyên-kháng thể.

73

Trong chương này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát triển cảm biến EIS sử dụng (i) đầu thu sinh học tự nhiên - kháng thểENRO và (ii) đầu thu sinh học nhân tạo kháng nguyên ENRO-MIP đểxác định nồng độ kháng nguyên ENRO trong dung dịch bằng phương pháp đo phổ tổng trở faradic. Bộ phận chuyển đổi (transducer) của cảm biến là điện cực mực in các bon (SPCE) được phủ lớp hạt nano vàng (AuNPs) phân tán đều trên bề mặt bằng phương pháp điện hóa quét thế tuần hoàn. Phép đo quang phổRaman được thực hiện sau mỗi bước chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo MIP nhằm xác định sự có mặt hoặc vắng mặt của phân tử chất in (kháng nguyên ENRO) trong mạng polyme MIP. Phương pháp quang phổ Raman dựa trên cơ sở tán xạ của chùm ánh sáng đơn sắc khi chiếu vào mẫu đo, tạo ra ánh sáng tán xạ Raman được ghi nhận lại bằng phần tử thu quang. Vạch phổ Raman cung cấp thông tin vềdao động phân tử và cấu trúc tinh thể. Quang phổRaman được sử dụng rộng rãi trong phân tích các hợp chất hữu cơ do mỗi nhóm chức hữu cơ có đặc trưng riêng về tần số hấp thụ. Dựa vào cường độđỉnh phổ Raman cho biết định lượng của nồng độ chất. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đã khảo sát hoạt động của cảm biến sử dụng đầu thu sinh học enzyme HRP xác định nồng độ H2O2 và cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo enzyme HRP-MIP để xác định enzyme HRP thông qua phản ứng oxy hóa - khử của enzyme HRP với H2O2 trong dung dịch đệm PBS (pH 6,0) bằng phương pháp quét thế tuần hoàn. Việc phát triển cảm biến này với mục đích tạo ra phương pháp kiểm tra chéo chứng minh tính đúng đắn của phương pháp phát triển cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tại MIP.

4.1. Khảo sát hoạt động của cảm biến miễn dịch sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên học tự nhiên

Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt động của của hai loại cảm biến miễn dịch sử dụng kháng thểENRO đã chế tạo bằng cách đo phổ EIS. Hoạt động của cảm biến được khảo sát trong dải nồng độ của kháng nguyên ENRO từ 1 đến 25 ng/mL. Kháng nguyên ENRO được pha trong PBS 10 mM pH 7,4. Nhỏ 2 μL dung dịch chứa kháng nguyên ENRO lên điện cực làm việc và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút đểđảm bảo xác xuất lớn nhất các phân tử ENRO liên kết với kháng thể. Sau đó, rửa sạch điện cực với nước cất để loại bỏ các phân tử không liên kết hoặc liên kết không bền vững. Điện cực được sấy nhẹ bằng dòng khí N2. Cuối cùng tiến hành đo phổ EIS trong dải tần số từ50 mHz đến 100 kHz với điện áp xoay chiều 10 mV trong dung dịch gồm K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 5 mM và KCl 0,1 M. Hình 4.1 trình bày đặc trưng phổ EIS của cảm biến tại các nồng độ kháng nguyên khác nhau. Kết quả cho thấy đường kính bán cung Nyquist (tương đương giá trị điện trở kháng truyền điện tử RCT) tăng tương ứng với nồng độ kháng nguyên ENRO. Sựtăng này có thể được giải thích là do kháng nguyên liên kết với kháng thể tạo thành một lớp điện môi ngăn cản quá trình truyền điện tử đến điện cực. Có thể