CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Quy trình công nghệ chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo MIP
2.2.4.1. Cảm biến ENRO-MIP
Quy trình công nghệđược trình bày trên hình 2.4. Đối với cảm biến này, có các kỹ thuật được thêm vào như sau:
32
Bước 1: Tạo màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) của Cysteamine và p-aminothiophenol trên điện cực AuNPs-SPCE.
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên
kháng thể ENRO và đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP.
Bước 2: Hoạt hóa nhóm -COOH của kháng thể ENRO bằng NHS và EDC. Kháng thể ENRO được pha trong dung dịch đệm PBS 100 mM (pH là 7,4) với nồng độ 500 ng/mL. Hỗn hợp dung dịch gồm NHS và EDC được pha trong đệm MES (pH 4,7) có nồng độ lần lượt là 0,1 M và 0,2 M. Lấy 10 µL hỗn hợp dung dịch EDC-NHS này cho vào 90 µL dung dịch kháng nguyên ENRO, vortex nhẹ bằng máy vortex và để hỗn hợp trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Lúc này, EDC-NHS sẽ phản ứng với nhóm cacboxyl của kháng thểENRO để tạo thành nhóm ester trung gian có khảnăng liên kết với nhóm amin (-NH2) của màng SAM để tạo thành liên kết amit bền vững.
Bước 3: Cốđịnh kháng thểENRO đã hoạt hóa nhóm -COOH. Nhỏ 2 µL kháng thể ENRO đã được hoạt hóa nhóm -COOH ở nồng độ 500 ng/mL lên điện cực SAM/AuNPs-SPCE và ủở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 giờ. Trong bước công nghệ này, nhóm NHS-este của kháng thể ENRO sẽ liên kết với nhóm amin (-NH2) của màng SAM để tạo thành liên kết amit bền vững giữa kháng thể ENRO và màng SAM. Dẫn tới kháng thể ENRO sẽđược cốđịnh trên bề mặt điện cực. Sau đó, điện cực được
33
rửa bằng nước cất để loại bỏ các liên kết yếu và các kháng thể không liên kết. Điện cực được sấy nhẹ bằng dòng khí N2 và tiến hành bước công nghệ tiếp theo.
Bước 4: Khóa bề mặt điện cực bằng ethanolamine. Để tránh liên kết không đặc hiệu, sau bước cốđịnh được kháng thể ENRO, chúng tôi tiến hành khóa các gốc tự do trên bề mặt điện cực bằng cách ngâm điện cực vào 120 µL dung dịch ethanolamine 100 mM trong 1 giờ tại nhiệt độ phòng. Sau đó, điện cực được rửa sạch bằng dung dịch PBS 10 mM và nước đề ion, rồi được sấy khô bằng dòng khí N2 nhẹ. Sau bước này, cảm biến đã được chế tạo hoàn chỉnh và sẵn sàng sử dụng xác định nhanh kháng nguyên ENRO.
Bước 5: Thực hiện phản ứng tương tác liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể ENRO. Kháng nguyên ENRO được pha trong PBS 100 mM (pH 7,4) với nồng độ 100 ng/mL. Nhỏ 2µL dung dịch này lên điện cực (kháng thể ENRO/SAM/AuNPs-SPCE), để ở nhiệt độphòng trong 15 phút. Sau đó, điện cực được rửa với nước cất và sấy nhẹ bằng khí N2.
Tiếp theo, quá trình tạo polyme MIP được thực hiện như đã trình bày ở trên.