Cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa dựa trên nguyên tắc nhận biết tương tác sinh học xảy ra trên bề mặt điện cực làm việc thông qua sựthay đổi trở kháng của hệ điện hóa. Khi đặt điện áp kích thích dao động biên độ nhỏ xoay chiều hình sin lên một hệ điện hóa thì trong hệ điện hóa sẽ xuất hiện một dòng điện đáp ứng hình sin cùng tần sốgóc ω nhưng lệch pha một góc θ so với điện áp đặt vào [20], [21].
( )ω = 0 i tω U U e (1.1) ( ) ( ) 0 ω θ ω = i t+ I I e (1.2)
Tổng trở của hệlúc này được biểu diễn như sau:
( )ω = ( ) ( )ω / ω = 0/ 0 −iθ =| | e−iθ
Z U I U I e Z (1.3)
Z(ω) cũng có thể được biểu diễn dưới dạng hàm phức trong đó Z’ là thành phần thực và Z” là phần ảo: ( ) ' " Z ω = +Z jZ (1.4) ( ) ( )2 2 2 | Z | = Z' + Z" (1.5)
Trong đó: Z' | Z | cos= θ, Z" | Z | sin= θ, arctang( ") '
θ = Z
Z .
Kết quả khảo sát phổ tổng trở theo tần sốthu được sẽđược biểu diễn trên mặt phẳng Nyquist [Z'( ) . "( )ω vs Z ω ] hoặc mặt phẳng Bode [Z( )ω . vs f] hay [logZ( )ω . logvs ( )f ]. Bằng cách quét tần số liên tục từcao đến thấp với thế một chiều đặt trên điện cực làm việc cốđịnh ta thu được phổ tổng trở của cảm biến. Phổ tổng trở thực nghiệm sẽđược xử lý và mô phỏng bằng một mạch điện tương đương mà trong đó mỗi phần tử của mạch điện sẽđại diện cho một tính chất điện của hệđiện hóa.
Phép đo phổ tổng trở được khảo sát trong dung dịch điện ly có cặp chất ôxy hóa- khửđược gọi là phổ tổng trở Faradaic (EIS faradaic); trong dung dịch điện ly không có cặp chất ôxy hóa-khửđược gọi là phổ tổng trở không Faradaic (EIS nonfaradaic) [20]. Trong trường hợp không sử dụng cặp oxi hóa khử (nonfaradaic), sựthay đổi giá trị trở kháng của cảm biến được đo trực tiếp ngay trong quá trình tương tác của chất
Điện cực làmviệccácbon (2,64 mm2) Điện cực đối Điệnso sánh Ag/AgCl Vùngmặt nạkhông thấm nước Tiếpxúc thiết bị 4 mm 12, 5 m m Điện cực làmviệcvàng (3,67 mm2) (a) (b)
11
cần phân tích với vật chất trên bề mặt điện cực. Với phương pháp này, trở kháng phụ thuộc nhiều vào sựthay đổi hàm lượng, sựbám dính và đặc trưng hình thái bề mặt của điện cực cảm biến. Trong trường hợp sử dụng cặp chất oxy hóa - khử (faradaic), sựthay đổi trởkháng được đo sau khi kết thúc quá trình tương tác của chất cần phân tích với vật chất trên bề mặt điện cực cảm biến. Vì vậy, phương pháp đo phổ tổng trở faradaic là phương pháp hiệu quả cho phép khảo sát sựthay đổi trên bề mặt điện cực. Ứng dụng trong cảm biến sinh học, phương pháp này cho phép phát hiện được sự hình thành tương tác liên kết giữa kháng thểvà kháng nguyên, DNA dò và DNA đích, phản ứng giữa enzyme và cơ chất hoặc quá trình tái liên kết giữa chất phân tích với đầu thu nhân tạo dạng MIP của chúng. Ưu điểm của phương pháp EIS là không gây phá hủy mẫu, độ chính xác cao và hoàn toàn có thể thực hiện được với môi trường có độ dẫn kém.
Mô hình mạch tương đương Randles như trình bày trong hình 1.5 [20], [22], [23] được áp dụng đối với hệđiện hóa khảo sát trong dung dịch điện ly, mạch điện gồm 3 thành phần: Rslà điện trở của dung dịch điện ly, Rp điện trở phân cực và Cdllà điện dung lớp kép. Trong đó, điện trở dung dịch điện ly (Rs) phụ thuộc vào nồng độ ion, loại ion. Điện dung lớp kép (Cdl) là do các ion trong dung dịch điện ly tích tụ trên bề mặt điện cực và sinh ra lớp điện tích phân cực gần sát bề mặt điện cực. Thành phần của mạch Randles sẽ thay đổi, Rp được thay thế bởi Rct và trở kháng Warburg ZW
trong trường hợp dung dịch điện ly có cặp chất ôxy hóa-khử, cặp ion này phản ứng sẽ sinh ra (hoặc mất đi) điện tử trong dung dịch điện ly. Điện trở truyền điện tích (Rct) đặc trưng cho quá trình truyền điện tích giữa dung dịch điện ly và điện cực làm việc, giá trị Rct phụ thuộc vào độ dẫn và hình thái bề mặt điện cực. Trở kháng Warburg (ZW) đặc trưng cho quá trình khuếch tán của ion đến bề mặt điện cực, trở kháng này có giá trị rất nhỏ tại vùng tần số cao và giá trị lớn tại vùng tần số thấp [20], [24]. Hai đại lượng Rs và ZWđặc trưng cho các tính chất của dung dịch điện phân và sự khuếch tán của cặp chất dò. Trong khi Cdl và RCT phụ thuộc vào tính chất cách điện và dẫn điện tại bề mặt tiếp xúc giữa điện cực và chất điện phân. Vì vậy, chúng thường được lựa chọn làm tín hiệu phát hiện của cảm biến đểxác định nồng độ các chất cần phân tích. Sựthay đổi về giá trị của Cdl không nhiều so với RCT khi có sựthay đổi nhỏ về hình thái bề mặt của điện cực. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng RCT làm tín hiệu đầu ra của cảm biến.
Hình 1.5. Mô hình mạch điện tương đương Randles mô phỏng tính chất điện của hệ điện hóa
12
Điện trở truyền điện tích RCT: Xem xét một hệđiện cực được nhúng vào dung dịch điện ly. Khi phản ứng xảy ra trên điện cực, các phân tử trên bề mặt điện cực bị oxi hóa theo phản ứng tổng quát:
Chất khử↔ Chất oxy hóa + ne-
Điện trở truyền điện tích đặc trưng cho quá trình oxy hóa khử trên có thểđược mô tả bởi công thức:
[ ]
( 2 2 ) 1
CT ct
R =RT n nF ARk S − (1.6)
Trong đó, T: nhiệt độ tuyệt đối F: hằng số Faraday
n: sốđiện tử liên quan trong các phản ứng điện cực
kct: hằng số tốc độ truyền điện tích (phụ thuộc điện thế) A: diện tích bề mặt điện cực
[S]: nồng độ chất tham gia phản ứng oxy hóa khử
Khi trạng thái cân bằng ổn định xảy ra ở một tín hiệu nhỏ, điện trở này có thể viết dưới dạng đơn giản hơn:
0 CT RT R nFI = (1.7)
Với Io là mật độ dòng truyền điện tích và các thông sốnhư trên.
Như vậy, điện trở RCT là một thành phần quan trọng của hệđiện cực. Nó thể hiện độ dẫn của màng sinh học được cốđịnh trên bề mặt điện cực và tốc độ chuyển đổi tín hiệu của một cảm biến sinh học.
Cảm biến dựa trên phép đo phổ tổng trởđược chia làm hai loại là cảm biến kiểu tụ và cảm biến phổ tổng trở. Cảm biến sinh học kiểu tụ (capacitive biosensor) dựa trên sự thay đổi điện dung để xác định chất cần phân tích. Các cảm biến kiểu tụ có cấu trúc điện cực kim loại (vàng, platin) trên đế vật liệu bán dẫn (Si/SiO2) hoặc ôxít kim loại (Ti/TiO2, Ta/Ta2O5) [20]. Bề mặt điện cực được biến tính bởi màng đơn lớp tự lắp ghép SAM hoặc vật liệu polyme đóng vai trò như một lớp điện môi trên bề mặt và cốđịnh đầu thu sinh học. Điện dung của cảm biến được mô tả gồm 3 tụđiện mắc nối tiếp nhau bao gồm: tụ điện ở gần sát bề mặt điện cực được tạo bởi lớp điện môi và điện dung lớp kép, tụđiện do đầu thu sinh học cốđịnh trên bề mặt điện cực và tụ điện do sự có mặt của đối tượng cần phân tích như trình bày trên hình 1.6 [23]. Giá trịđiện dung tổng được biểu diễn qua công thức:
1
𝐶𝐶 = 𝐶𝐶 1
đ𝑖𝑖ệ𝑛𝑛𝑚𝑚ô𝑖𝑖 + 𝐶𝐶 1
đầ𝑢𝑢𝑡𝑡ℎ𝑢𝑢𝑠𝑠𝑖𝑖𝑛𝑛ℎℎọ𝑐𝑐 + 𝐶𝐶 1
13
Hình 1.6. Mô hình cấu trúc cảm biến miễn dịch kiểu tụ và mạch điện tương đương
Khi có tương tác giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích trên bề mặt điện cực, giá trị điện dung của cảm biến sẽthay đổi [22]. Để tăng độ nhạy của cảm biến kiểu tụthì điện dung của lớp điện môi phải đủ lớn để sựthay đổi giá trịđiện dung của cảm biến chỉ phụ thuộc vào điện dung của chất cần phân tích [25]. Bên cạnh cấu trúc điện cực đơn, cảm biến kiểu tụ còn được phát triển dựa trên điện cực răng lược với đầu thu sinh học được cố định trên bề mặt điện cực và vùng khe hẹp giữa hai điện cực. Điện dung của cảm biến tụ cấu trúc điện cực răng lược bao gồm giá trị điện dung tại vùng bề mặt điện cực và điện dung do sựthay đổi hằng sốđiện môi tại khe hẹp giữa các điện cực răng lược [27]-[30].
Cảm biến sinh học phổ tổng trở (impedimetric biosensor) dựa trên sựthay đổi trở kháng phức của cảm biến khi cảm biến được khảo sát trong dung dịch điện ly có cặp chất ôxy hóa-khử [20]. Hai loại cặp chất ôxy hóa-khử thường được sử dụng là cặp anion [Fe(CN)6]3-/4- và cặp cation [Ru(NH3)6]2+/3+; các cặp chất này được lựa chọn dựa trên các thông sốnhư điện tích, kích thước của các ion [30], [31]. Điện tử sinh ra từ phản ứng ôxy hóa khử của cặp chất dò di chuyển từ dung dịch điện ly đến điện cực làm việc (hoặc ngược lại) phụ thuộc vào điện áp phân cực trên điện cực làm việc. Phổ tổng trở của cảm biến được mô phỏng bởi mô hình mạch điện Randles trong đó giá trị điện trở truyền điện tích Rct được chọn làm tín hiệu của cảm biến (hình 1.7b). Nguyên lý cơ bản của cảm biến phổ tổng trở dựa trên sự cản trở (hoặc tăng cường) chuyển động của cặp chất ôxy hóa-khử trong dung dịch điện ly đến và bề mặt điện cực. Khi có sự bắt cặp giữa đầu thu sinh học và đối tượng cần phân tích sẽ hình thành lớp điện môi cản trở cặp chất dò đến bề mặt điện cực làm giá trị điện trở truyền điện tích Rct tăng (hình 1.7a,c). Bên cạnh đó, do các thành phần sinh học mang điện tích nên sẽ hình thành lớp điện tích trên bề mặt điện cực; lực tương tác tĩnh điện (lực hút hoặc lực đẩy) sẽlàm tăng cường hoặc suy giảm dòng các ion trong dung dịch điện ly đến bề mặt điện cực [30]. Cảm biến phổ tổng trở có độ nhạy cao hơn và không yêu cầu lớp vật liệu điện môi trong cấu trúc điện cực như cảm biến kiểu tụ. Cảm biến loại này có độổn định cao, cảm biến không những cho phép phân tích nồng độ của đối tượng cần phát hiện mà còn cho phép khảo sát qua từng bước công nghệ chế tạo cảm biến. Cảm biến loại này được ứng dụng để phát hiện DNA [37], kháng nguyên-kháng thể [33], [34], phát hiện các phân tử nhỏ [35], [36], phát hiện vi khuẩn [37]…
14
Hình 1.7. Cảm biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa sử dụng chất dò [Fe(CN)6]3-/4-; (a) đầu thu kháng thể cố định trên điện cực vàng, (b) mạch tương đương Randles, (c) đầu thu kháng thể liên kết đặc hiệu với kháng nguyên cản trở quá trình truyền điện tích đến điện cực và (d) phổ tổng trở biểu diễn trên mặt phẳng Nyquist của cảm biến trước và sau phản ứng miễn dịch
[23].
Ưu điểm của cảm biến phổ tổng trở là có thể phân tích một cách trực tiếp thông qua phản ứng đặc hiệu giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích, điều này giúp cho cảm biến có thể phát hiện các loại đối tượng sinh học đa dạng. Cảm biến phổ tổng trở có độ nhạy và độổn định cao, điện áp đặt trên điện cực nhỏ nên không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của thành phần sinh học như trong cảm biến đo dòng và đo thế [30].