CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.3. Phương pháp phân tích HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tích ra đời từ những năm 1967-1968 dựa trên cơ sở cải tiến từ phương pháp sắc ký cổ điển. HPLC thường được dùng để tách chiết, nhận biết, định lượng thành phần các chất phân tích với độ nhạy cao, khảnăng phân tích định lượng tốt, đặc biệt là khảnăng
46
tách chiết các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị nhiệt phân [159]. Một thiết bị HPLC đặc thù gồm có cổng lấy mẫu, bơm, và một đầu dò. Cổng lấy mẫu đưa hỗn hợp mẫu vào dòng pha động để đi qua cột (xem hình 2.14). Hệ thống bơm có nhiệm vụđảm bảo tốc độ dòng mong muốn và ổn định thành phần của pha động qua cột. Đầu dò tạo ra tín hiệu tỷ lệ với lượng mẫu thành phần đi ra từ cột, do đó cho phép phân tích định lượng của những thành phần trong mẫu. Một bộ vi xử lý số và phần mềm có tác dụng điều khiển thiết bị HPLC và cung cấp dữ liệu phân tích. Một vài mẫu bơm cơ học trong thiết bị HPLC có thể trộn nhiều dung môi với nhau theo tỉ lệ có thể thay đổi được theo thời gian, nhiệm vụ là tạo ra gradient nồng độ trong pha động.
Hình 2.14. Sơ đồ cấu tạo của một hệ sắc kí lỏng hiệu năng cao.
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography), sắc ký phân bố (partition chromatography), sắc ký ion (ion chromatography), sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography). Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký. Ví dụ, sắc ký hấp thụthì pha tĩnh là chất hấp phụ, sắc ký trao đổi ion thì pha tĩnh là chất trao đổi ion, sắc ký phân bố hay sắc ký chiết thì pha tĩnh là các chất lỏng, sắc ký gel hay rây phân tửthì pha tĩnh là các hợp chất có dạng gel. Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha động. Pha động có tác dụng như một chất mang để vận chuyển các cơ chất có trong chất phân tích đến pha tĩnh phục vụ cho quá trình rửa giải. Quyết định hiệu quả của quá trình tách chiết trong sắc ký là tổng hợp các tương tác. Đối với một hệ sắc kí, các tương tác trong hệ được mô tả bởi 3 tương tác chủ yếu là tương tác giữa chất phân
47
tích với pha động, chất phân tích với pha tĩnh và tương tác giữa pha động với pha tĩnh như sơ đồđược trình bày trên hình 2.15.
Hình 2.15. Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải.
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên tương ứng với lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại. Đối với mỗi chất, khảnăng giữ lại các cơ chất phụ thuộc bởi ba lực F1, F2, F3, trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố có ảnh hưởng không đáng kể. Ởđây F1 là lực giữ chất phân tích lại trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau dẫn đến các chất khác nhau sẽ có tốc độ di chuyển trong cột khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột như hình 2.16.
Hình 2.16. Quá trình rửa giải và tách píc của chất A và chất B.