Kết hợp với phương pháp điện hóa chúng tôi sử dụng một phương pháp phân tích phương pháp quang phổ UV-vis. Để có thể nghiên cứu nồng độ của kháng sinh trong thuốc bằng phương pháp UV-vis chúng tôi tiến hành phân tích xây dựng đường đặc trưng chuẩn thể hiện sự phụ thuốc của píc hấp thụcường độ hấp thụ vào nồng độ kháng sinh NOR. Kháng sinh NOR được đo trong dải nồng độ từ 1 µg/mL đến 40 µg/mL.
Chúng tôi phân tích với dải bước sóng từ 200 đến 400 nm do kháng sinh Norfloxacin thuộc họ quinolone có đặc tính hấp thụ mạnh trong tia cực tím. Chúng tôi phân tích từng nồng độ trong dải nồng độ trên. Trên đặc trưng phổ xuất hiện 3 đỉnh phổ tại tại 3 bước sóng 225, 277 và 310, đây là 3 bước sóng đặc trưng của Norfloxacin trong độ pH thấp [4].
110
Hình 5.19. Phổ hấp thụ UV-VIS khi phân tích kháng sinh Norfloxacin (a) và đường chuẩn
(b) trong dải nồng độ từ 1 µg/mL đến 40 µg/mL.
Hình 5.19a thể hiện đặc trưng quang phổ UV-vis khi phân tích kháng sinh Norfloxacin trong dải nồng độ từ 1 µg/mL đến 40 µg/mL. Qua từng nồng độ đo, chúng tôi nhận thấy bước sóng 277 là bước sóng cho sựthay đổi lớn nhất. Chính vì vậy chúng tôi sử dụng diện tích của đỉnh bước sóng 277 làm giá trịđể xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn của phương pháp được thể hiện trong hình 5.19b, ta có thể thấy có 2 vùng tuyến tính từ1 đến 20 µg/mL và từ20 đến 40 µg/mL. Đường chuẩn có độ tuyến tính cao R2= 0,99 với dải nồng độ thấp và R2= 0,98 với dải nồng độ cao.
Hình 5.20. Đặc trưng quang phổ UV-VIS khi phân tích thuốc kháng sinh Norfloxacin 400
mg được pha loãng xuống 20.000, 40.000 và 200.000 lần.
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu thuốc được pha loãng xuống 20.000, 40.000 và 200.000. Kết quảphân tích được thể hiện trong hình 5.20. Kết quả cho thấy có 3 đỉnh ứng với 3 bước sóng 224, 277 và 316 nm, đây là 3 bước sóng của kháng
111
sinh Norfloxacin. Chúng tôi tiến hành đo phân tích mỗi nồng độ 3 lần, kết quả cho thấy diện tích của đỉnh 277 thay đổi rất nhỏ (< 4%).
Từ giá trị trung bình này của đỉnh chúng tôi tính được nồng độ kháng sinh NOR trong thuốc (bảng 5.10). Tính ngược lại giá trị ban đầu trước khi pha loãng và giá trị trung bình của 3 lần pha loãng chúng tôi tính được giá trị của nồng độ kháng sinh là 398,30 ±0,2. Giá trị này lệch 0,4 % so với giá trị của nhà sản xuất (400 mg). Điều này là chấp nhận được trong sản xuất thuốc. Qua 2 phương pháp đều cho kết quả hàm lượng kháng sinh trong thuốc kháng sinh NOR 400 mg là đúng với giá trị của nhà sản xuất. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích sử dụng cảm biến NOR-MIP/EIS.
Như vậy, kết quả này một lần nữa chứng minh khả năng phân tích định lượng của cảm biến do chúng tôi chế tạo dựa trên công nghệ polyme in phân tử với phân tích, định lượng nhanh kháng sinh Norfloxacin trong dược phẩm.
Bảng 5.10. Nồng độ kháng sinh NOR tính theo diện tích đỉnh tại bước sóng 277.
Pha loãng (lần) Diện tích đỉnh (277) Nồng độ kháng sinh NOR (μg/mL) 200.000 4,43 (±0,2) 1,98 (±0,10) 40.000 21,46 (±0,4) 10,04 (±0,20) 20.000 42,10 (±0,4) 19,79 (±0,20) 5.5. Cảm biến CF-MIP
5.5.1. Khảo sát hình thái bề mặt điện cực cảm biến
Trong quá trình nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học phân tích định lượng kháng sinh Ciprofloxacin, chúng tôi đã tiến hành khảo sát hình thái bề mặt của điện cực cảm biến chế tạo theo phương pháp 1 và 2 bằng phương pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM). Trên hình 5.21 trình bày ảnh SEM của bề mặt điện cực cảm biến chế tạo theo phương pháp 1 và phương pháp 2. Kết quả cho thấy quá trình tạo hạt nano vàng trên đế rất thành công, hạt vàng được phân bố phân tán trên bề mặt điện cực và lớp màng polyme-MIP hình thành trên lớp hạt vàng đó. Hơn nữa, kết quả phân tích SEM cũng cho thấy sự khác biệt về hình thái màng polyme-MIP đã tổng hợp được theo hai phương pháp. Trên điện cực cảm biến chế tạo theo phương pháp 2 đã có sự hình thành của các chuỗi mầm poly(aminothiophenol) ngắn và màng polyme- MIP phát triển bao quanh các chuỗi mầm này.
112
Hình 5.21. Ảnh SEM hình thái bề mặt điện cực cảm biến chế tạo theo phương pháp 1 và
phương pháp 2.
5.5.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến với đầu thu CF-MIP chế tạo theo phương pháp 1 phương pháp 1
5.5.2.1. Đặc trưng phổ tán xạ Raman
Trong quá trình chế tạo đầu thu CF-MIP, chúng tôi đã tiến hành đo quang phổ tán xạRaman để phân tích sự hiện diện của các hóa chất và các chất sinh học trên bề mặt điện cực cảm biến sau mỗi bước chế tạo. Trên hình 5.22 trình bày đặc trưng phổ tán xạ Raman của bề mặt cảm biến sau các bước như sau: in phân tử CF vào mạng poly(aminothiophenol), loại bỏ phân tử CF ra khỏi mạng poly(aminothiphenol) hình thành đầu thu CF-MIP và tái liên kết các phân tử CF với đầu thu CF-MIP của chúng. Với điện cực sau bước in phân tử CF vào mạng poly(aminothiophenol), chúng tôi ghi nhận sự xuất hiện của 2 vạch phổcó cường độ lớn tại vị trí số sóng 1580 cm-1 và 1337 cm-1, đây chính là hai vạch phổđặc trưng của dao động liên kết C-C trong mạng Carbon (G-band) và khuyết tật trong mạng (D-band) [25]. Tiếp theo là sự xuất hiện của các vạch phổ tại vị trí 1072 cm-1, 1140 cm-1, 1189 cm-1, đây là các vạch phổđặc trưng cho mạng poly(aminothiophenol). Các vạch phổ này tương ứng với mode dao động của liên kết C-S, C-C, C-N và mode dao động uốn cong của liên kết C-H [26]. Trong phổđặc trưng Raman, chúng tôi cũng ghi nhận được dịch chuyển Raman xảy ra tại các số sóng tại 816 cm-1, 1390 cm-1, 1439 cm-1 và 1623 cm-1. Đây chính là các vạch phổ đặc trưng của phần tửkháng sinh CF. Trong đó, vạch phổ 1623 cm-1đặc trưng cho dao động rung bất đối xứng của liên kết đôi C=C và của vòng thơm, vạch 1390 cm-1đặc trưng cho dao động đối xứng của gốc COO-, vạch 1439 cm-1đặc trưng cho dao động rung đối xứng của nhóm O-C-O của gốc carboxyl, vạch 816 cm-1đặc trưng cho dao động rung đối xứng của liên kết C-F [27].
113
Hình 5.22. Đặc trưng phổ tán xạ Raman của bề mặt cảm biến sau bước in phân tử CF vào
mạng polyme (polyme-MIP/AuNPs-SPCE), sau bước loại bỏ phân tử CF ra khỏi mạng poly(aminothiphenol) hình thành đầu thu CF-MIP và sau bước tái liên kết các phân tử CF
với đầu thu CF-MIP của chúng (Tái liên kết của CF 1µM).
Như vậy, kết quả phổ tán xạ Raman cho thấy các phân tửCF đã được in vào mạng polyme. Sau bước loại bỏ CF, chúng tôi cũng tiến hành đo đặc trưng quang phổ tán xạ Raman. Kết quả cho thấy không tồn tại dịch chuyển Raman tại các số sóng 816 cm-1, 1390 cm-1, 1439 cm-1 và 1623 cm-1. Điều này chứng tỏ phân tửCF đã được tách loại ra khỏi mạng polyme-MIP hình thành đầu thu CF-MIP. Sau đó, chúng tôi cho điện cực chứa đầu thu CF-MIP tiếp xúc với dung dịch chứa 1 µM CF và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, trên đặc trưng phổ Raman xuất hiện trở lại các vạch phổđặc trưng của phân tử CF. Sự xuất hiện của các vạch phổ này chứng tỏđã có sự tái liên kết giữa các phân tử CF với đầu thu CF-MIP của chúng. Kết quả này một lần nữa chứng tỏđầu thu CF-MIP đã được chế tạo thành công theo quy trình đề xuất của chúng tôi như đã trình bày trong phần thực nghiệm.
5.6.2.2. Xây dựng đường chuẩn của cảm biến sử dụng đầu thu CF-MIP bằng phương pháp phổ tổng trở điện hóa phương pháp phổ tổng trở điện hóa
Trên hình 5.23 trình bày phổ EIS của cảm biến CF-MIP và cảm biến NIP trước và sau khi được nhúng vào môi trường có chứa CF với nồng độ xác định. Kết quả cho thấy đường kính bán cung Nyquist của cảm biến CF-MIP tăng lên tương ứng với sựgia tăng nồng độ kháng sinh CF trong khi sự thay đổi này là rất nhỏ đối với cảm biến NIP. Thông qua khớp phổ EIS sử dụng mạch tương đương Randles, của cảm biến CF-MIP trong dải nồng độ kháng sinh CF từ0 ng/mL đến
114
13,24 ng/mL, giá trị điện trở truyền điện tích RCTtăng từ 0,12 kΩ đến 17,45 kΩ, trong khi đó với cảm biến NIP chỉ thay đổi cỡ 400 Ω trong dải nồng độ CF từ 0 ng/mL đến 33,1 µg/mL. Kết quả này cho thấy sự thay đổi của tín hiệu cảm biến (RCT) hoàn toàn là do sự tái liên kết của các phân tử CF với khuôn in đặc hiệu của chúng (đầu thu CF-MIP).
Hình 5.23. Phổ tổng trở điện hóa cảm biến A) CF-MIP và B) Cảm biến NIP.
Tiến hành xây dựng đường đặc trưng chuẩn của cảm biến CF-MIP thể hiện sự phụ thuộc của ∆RCT (sự thay đổi giá trị RCT của cảm biến tại nồng độ kháng sinh CF so với mẫu trắng) vào nồng độ kháng sinh CF (hình 5.24). Đường đặc trưng chuẩn được chia thành hai vùng tuyến tính ứng với nồng độ CF từ0,33 ng/mL đến 3,31 ng/mL và từ3,31 ng/mL đến 13,24 ng/mL.
Hình 5.24. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến CF-MIP với ∆RCT (kΩ) là hàm của nồng
độ CF (ng/mL). Tất cả các điểm đo trên đồ thị là giá trị trung bình của 03 cảm biến được chế tạo độc lập sử dụng cùng quy trình và thanh sai số chính là giá trị độ lệch chuẩn (cỡ 5 %).
Kết quả cho thấy cảm biến CF-MIP có khả năng phân tích định lượng kháng sinh CF trong dải nồng độ rộng từ 0,33 ng/mL đến 13,24 ng/mL. Sự phân thành hai vùng tuyến tính trên đặc trưng chuẩn có thểđược giải thích là do sốlượng đầu
115
thu CF-MIP có trên bề mặt điện cực. Ở nồng độ CF thấp (thấp hơn 3,31 ng/mL - 10 nM), số lượng đầu thu CF-MIP nhiều hơn nhiều so với số phân tửCF đến bề mặt điện cực làm cho xác suất phân tử CF có khảnăng tới tái liên kết với đầu thu cao dẫn tới sự thay đổi mạnh của RCT trong khi sự thay đổi nồng độ CF nhỏ (khoảng 1 nM). Ở vùng tuyến tính thứ hai (từ3,31 ng/mL đến 13,24 ng/mL), mặc dù nồng độ CF thay đổi cỡ 5 nM nhưng RCT tăng chậm có thể được giải thích là do bắt đầu chịu ảnh hưởng của sự hạn chế của số lượng đầu thu CF-MIP trên bề mặt điện cực cảm biến. Giới hạn phát hiện (LOD) của cảm biến tại hai vùng nồng độ từ 0,33 ng/mL đến 3,31 ng/mLvà từ3,31 ng/mL đến 13,24 ng/mL tương ứng lần lượt là 6,0 pg/mL và 15,4 pg/mL.
5.5.2.3. Xác định hàm lượng kháng sinh CF trong dược phẩm
Mẫu dược phẩm mà chúng tôi sử dụng để phân tích là mẫu thuốc nhỏ mắt có tên là Prolaxi được sản xuất bởi công ty Atco Laboratories., Ltd - Pakistan với thành phần Ciprofloxacin 0,3%. Thông tin về sản phẩm thuốc được trình bày trên hình 5.25.
Hình 5.25. Thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0,3% của hãng Atco Laboratories., Ltd – Pakistan.
Để phân tích hàm lượng CF có trong thuốc nhỏ mắt, chúng tôi đã sử dụng cảm biến đã chế tạo. Trên hình 5.26 trình bày phổ EIS của cảm biến CF-MIP và cảm biến NIP khi tiếp xúc với dung dịch thuốc nhỏ mắt với được pha loãng với số lần xác định. Kết quả cho thấy, đường kính của bán cung trên phổ EIS của cảm biến CF-MIP thay đổi rõ rệt khi tiếp xúc với thuốc nhỏ mắt, giá trị biến thiên điện trở truyền điện tích ∆RCT tăng từ 2,3 kΩ đến 6,5 kΩ khi nồng độ thuốc nhỏ mắt tăng lên từ 0,99 ng/mL đến 2,79 ng/mL. Trái lại, đối với cảm biến NIP sự thay đổi về đường kính bán cung là không đáng kể. Điều này chứng tỏ cảm biến đã chế tạo hoạt động tốt trong môi trường mẫu thực.
116
Hình 5.26. Đặc trưng EIS phân tích mẫu thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0.3% tại các nồng độ khác
nhau của (A) Cảm biến CF-MIP và (B) Cảm biến NIP.
Trên bảng 5.11 trình bày kết quả phân tích mẫu thuốc nhỏ mắt của cảm biến CF- MIP/EIS đã chế tạo. Tại nồng độ 0,99 ng/mL theo giá trị niêm yết của hãng, cảm biến CF-MIP/EIS phát hiện được nồng độ là 0,89 ng/mL, nhỏ hơn giá trị niêm yết của hãng. Tương tự như vậy, tại nồng độ 1,89 ng/mL và 2,79 ng/mL cảm biến CF- MIP/EIS phát hiện được nồng độ tương ứng là 1,94 ng/mL và 2,89 ng/mL.
Bảng 5.11. Kết quả phân tích định lượng nồng độ kháng sinh CF trong mẫu thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0,3% bằng cảm biến CF-MIP.
Theo đường chuẩn
∆RCT (Ω) = 2391,2*C (ng/mL) – 123,9 Đo thực nghiệm Sai số tương đối (%) Nồng độ CF theo giá trị niêm yết của hãng ∆RCT(Ω) ∆RCT(Ω) Nồng độ CF thực phát hiện 0,99 2343,4 2254,5 0,89 10,0 1,89 4395,5 4521,5 1,94 2,6 2,79 6547,5 6780,5 2,89 3,6
Như vậy kết quả cho thấy, với mẫu thực có nồng độ CF thấp hơn 1 ng/mL thì sai số tương đối giữa thực nghiệm và đường chuẩn là 10 %. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn thì sai số này rất nhỏ chỉ từ 2,6 đến 3,6 %. Căn cứ vào bảng giá trị này chúng tôi xác định được nồng độ kháng sinh CF có trong thuốc nhỏ mắt có giá trị nằm trong khoảng từ 3,02 mg/mL đến 3,10 mg/mL. Giá trị này hoàn toàn phù hợp với sai số ghi trên bao bì của sản phẩm là sai số nồng độ CF sử dụng trong sản phẩm có giá trị từ0,5% đến 3,5% (trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế).
Đánh giá chung, chúng tôi đã chế tạo thành công cảm biến sinh học sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo dựa trên công nghệ polyme phân tử nhằm phân tích định lượng kháng sinh Ciprofloxacin trong dược phẩm. Qua đó thành công bước đầu trong việc thẩm định nhanh chất lượng dược phẩm. Tuy nhiên, chúng tôi cũng đã sử dụng phương pháp đối chứng khác để phân tích định lượng CF so sánh với kết
117
quảthu được từ cảm biến do chúng tôi chế tạo. Phương pháp đối chứng chúng tôi sử dụng là phương pháp phân tích phổ hấp thụ UV-vis. Đây là phương pháp tiêu chuẩn được sử dụng hàng ngày trong nhiều phòng thí nghiệm khoa học đời sống phân tích các hóa chất và các mẫu sinh học do sự đơn giản, dễ thực hiện, đưa ra kết quả trong vài giây và vì nó là phương pháp không phá hủy, nên mẫu có thể được sử dụng cho các phân tích sau. Kết quả phân tích phổ hấp thụ UV-vis được trình bày trong phần tiếp theo.
Hình 5.27. Phổ hấp thụ UV-vis của Ciprofloxacin ở các nồng độ khác nhau.
Trên hình 5.27 trình bày đặc trưng phổ UV-vis của kháng sinh CF. Trên đặc trưng phổ xuất hiện 3 đỉnh phổ tại bước sóng 277 nm, 317 nm và 332 nm. Đây chính là những phổđặc trưng của phân tử CF. Trên bảng 5.12 trình bày giá trị bước sóng mà tại đó xuất hiện đỉnh phổ khi phân tích phổ hấp thụ UV-vis của một số kháng sinh nhóm Quinolone pha trong đệm HCl 0,1N [28].
Bảng 5.12. Bảng tổng hợp các giá trị bước sóng mà tại đó xuất hiện đỉnh phổ khi phân tích phổ hấp thụ UV-vis của một số kháng sinh nhóm Quinolone pha trong đệm HCl 0.1N [28]. Kháng sinh γ1 (nm) γ2 (nm) γ3 (nm) γ4 (nm) Ciprofloxacin (CF) - 279 317 330 Norfloxacin (NOR) 225 278 317 - Levofloxacin (LEV) 228 295 327 - Ofloxacin (OFL) 227 295 327 -
118
Tiến hành xây dựng đặc trưng chuẩn cho phân tích định lượng nồng độ kháng sinh CF bằng phương pháp phân tích phổ hấp thụ UV-vis, đường chuẩn được trình bày trên hình 5.28.
Hình 5.28. Đường đặc trưng chuẩn xác định nồng độ kháng sinh Ciprofloxacin bằng
phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ UV-VIS.
Đường đặc trưng chuẩn được xây dựng dựa trên sự phụ thuộc của cường độ phổ