- Môi trường bổ sun g2 (g/l):
3. BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT
1.2. Dinh dưỡng nitrogen
Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitrogen trong các quá trình sống để xây dựng tế bào. Tất cả các thành phần quan trọng của tế bào đều có chứa nitrogen (protein, acid nucleic, enzyme…). Tất cả các loại protein đều được cấu tạo từ các amino acid. Các amino acid có trong tế bào vi sinh vật ở dạng tự do là nguyên liệu để tổng hợp các phân tử protein. Các amino acid được tạo thành do quá trình trao đổi carbon và nitrogen. Việc tổng hợp các amino acid trải qua hàng loạt các phản ứng phức tạp với sự xúc tác của nhiều enzyme khác nhau, gồm hai loại phản ứng cơ bản có trong tế bào vi sinh vật là phản ứng amine hóa và phản ứng chuyển amine.
Phản ứng amine hóa gồm hai giai đoạn: giai đoạn thứ nhất là việc tạo thành iminoacid nhờ liên kết với NH3 khơng có sự tham gia của enzyme, giai đoạn thứ hai là giai đoạn khử nhóm imine thành amine dưới tác dụng của dehydrogenase:
Một số amino acid được tạo thành nhờ phản ứng chuyển nhóm amine cho α – cetoacid:
Các amino acid tạo thành được hoạt hóa sẽ liên kết với RNA hịa tan rồi chuyển vào ribosome, ở đây xảy ra sự tổng hợp các mạch peptide và protein. Một số amino CH3 – CO – COOH acid pyruvic + CH3 – C = (NH) - COOH + H2O NADH2 Alanine-dehydrogenase CH3CH(NH2)COOH alanine NH3 COOH CH – NH2 CH2 COOH Acid aspartic + COOH CO R α–cetoacid COOH CO CH2 COOH Acid oxaloacetic + COOH CO – NH2 R Amino acid
acid được tổng hợp với lượng quá nhiều so với nhu cầu sinh lý của vi sinh vật sẽ được tiết vào môi trường nuôi cấy. Hiện tượng này gọi là hiện tượng “siêu tổng hợp” và được áp dụng vào công nghiệp lên men các amino acid.
Nitrogen trong khơng khí rất phong phú, song nó cũng rất bền vững về mặt hóa học, khó bị khử hoặc bị oxy hóa, chỉ có một số vi sinh vật gọi là vi khuẩn cố định đạm mới có khả năng đồng hóa nitơ trong khơng khí.
Trong tất cả các mơi trường ni cấy cần thiết phải có các loại hợp chất nitrogen mà vi sinh vật có thể đồng hóa được. Việc chọn nguồn nitrogen là rất cần thiết để đảm bảo được hiệu suất cao và có lợi về mặt kinh tế trong sản xuất vi sinh vật. Các nguồn nitrogen dùng trong công nghiệp lên men thường là các hợp chất nitrogen hữu cơ và vơ cơ.
Các amino acid có thể được bổ sung vào môi trường dạng tinh khiết hoặc ở dạng hợp chất protein. Các amino acid ở đây không những là nguồn nitrogen mà cịn là nguồn carbon.
Các amino acid có mặt trong mơi trường thường khơng được vi sinh vật sử dụng trực tiếp ngay làm nguyên liệu xây dựng tế bào. Muốn sử dụng được các amino acid này vi sinh vật thường phải tiến hành hai loại phản ứng trao đổi chất: phản ứng khử amine và phản ứng khử carboxyl.
Phản ứng khử amine xảy ra trong điều kiện hiếu khí, NH3 được tách ra khỏi phân tử amino acid và tạo thành cetoacid.
Ở đây có sự tham gia của enzyme deaminase. Vùng hoạt động của enzyme này ở khoảng pH 6,5 – 7,5. Hoạt lực khử amine tùy thuộc vào chủng vi sinh vật và điều kiện ni cấy chúng. Như vậy chỉ có những loại vi sinh vật nào có khả năng khử amine mới có khả năng sử dụng amino acid. Trong q trình ni cấy các vi sinh vật này đều xảy ra các phản ứng khử amine. Ở giai đoạn đầu NH3 được tạo thành từ các amino acid có trong môi trường dinh dưỡng, ở giai đoạn cuối việc khử amine thực hiện ở những amino acid được tạo thành do hiện tượng tự phân của tế bào.
Khi pH môi trường chuyển về vùng acid sẽ xảy ra các phản ứng khử carboxyl các acid amin và tạo thành các amin: sản phẩm decarboxyl của một số acid amin có độc tố cao như lysine – cadaverin, octinin – putrexin. Ở tế bào xạ khuẩn và vi khuẩn thường thấy các phản ứng khử carboxyl của acid glutamic.
Các acid amin trong dạng hợp chất thường là các protein của đậu tương, khô lạc và pepton. Muốn đồng hóa được các hợp chất này vi sinh vật phải tiết vào môi trường hệ enzyme protease để thủy phân protein thành các amino acid. Rất nhiều lồi nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn có hoạt tính protease cao: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Actinomyces, Clostridium, Bacillus… Những amino acid, purine và pyrimidine là những nguồn nitrogen thích hợp hay được vi sinh vật sử dụng.
+ 1/2 O2 + NH3
R – CH – COOH
NH3
R – CH – COOH
Urea được dùng trong cơng nghiệp sinh tổng hợp có hai tác dụng: làm nguồn N và làm chất điều chỉnh pH, dưới tác dụng của enzyme urease, urea phân hủy thành CO2 và NH3.
Vi sinh vật thường khơng trực tiếp đồng hóa được nitrate mà phải trải qua các quá trình biến đổi:
AH2 là chất khử có trong mơi trường.
Quá trình này được thực hiện nhờ hệ enzyme nitratreductase
protease
(NH2)2CO + H2O 2 NH3 + CO2 urease
4AH2 + HNO3 NH3 + 3H2O
HNO3 HNO2 (HNO)2 NH2OH NH3 Acid nitric Acid nitrơ Hyponitric Hydroxylamine
Tổng hợp amino acid Tổng hợp protein Amino acid Protein NH3 protease Amino acid Protein Amino acid (sinh tổng hợp thừa) Các sản phẩm bậc hai khác Q trình xảy ra ngồi tế bào Q trình xảy ra ngồi tế bào Q trình xảy ra trong tế bào desaminase
Hình 3.5. Quá trình chuyển hóa nguồn nitrogen hữu cơ ở vi sinh vật
Tổng hợp amino acid Tổng hợp protein Amino acid NH3 HNO3 HNO2 Amino acid (sinh tổng hợp thừa) Các sản phẩm bậc hai khác Urea Muối ammon
Tất cả các lồi vi sinh vật đều đồng hóa được muối ammon. Việc sử dụng nguồn nitơ hữu cơ, ure và các muối ammon đều gắn liền với việc tách NH3 ra rồi hấp thụ vào tế bào. Như vậy, NH3 là trung tâm của các con đường dinh dưỡng nitrogen của vi sinh vật. Trong trường hợp dùng các muối ammon làm nguồn nitrogen thì vi sinh vật sử dụng các gốc acid ít hơn gốc ammon, vì vậy mơi trường sẽ chuyển về phía acid. Để ổn định pH người ta thường bổ sung vào môi trường CaCO3 để trung hịa các acid vơ cơ và hữu cơ tạo thành trong quá trình lên men.
Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật khơng những phụ thuộc vào chính bản thân nguồn nitrogen mà còn phụ thuộc vào cả tỷ số C:N trong mơi trường. Tỷ số này có nhiều ý nghĩa, tạo cho vi sinh vật khả năng trao đổi chất thích hợp, khả năng tích tụ cao các sản phẩm sinh tổng hợp và tạo thành các hệ enzyme để tiến hành các phản ứng sinh hóa theo hướng có lợi.