- Sự tạo thành ester: Cùng với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme esterase của nấm men, các acid và alcol tác dụng với nhau tạo ra các ester
5. CÁC CHẤT KHÁNG SINH
Năm 1929, nhà vi sinh vật học người Anh, Alexander Fleming nhận thấy một hiện tượng kỳ lạ trên đĩa thạch mà ông đã cấy tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) tình cờ nhiễm một loại nấm mà xung quanh khuẩn lạc của nó là một vùng trong, vi khuẩn không phát triển được. Ông đã tách chiết, phân lập và nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của nó và nấm này thuộc chi Penicillium, do vậy ông gọi tên nó là penicillin. Đấy là chất kháng sinh đầu tiên được tìm thấy.
Cho đến chiến tranh Thế giới II, với sự hợp tác của các nhà vi sinh vật Anh và Mỹ, chất kháng sinh của Fleming mới được bắt đầu sản xuất ở mức độ lớn và trở thành loại thuốc “thần kỳ” cứu sống nhiều người. Đến năm 1945, A. Fleming, E. Chain, H. Florey cùng được nhận giải Nobel về công trình penicillin.
5.1. Penicillin
5.1.1. Tác nhân vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật thuộc chi Penicillium và Aspergillus có khả năng sinh penicillin. Tuy nhiên chỉ có các loài Penicillium notatum và P. chrysogenum có hoạt tính kháng sinh cao và được dùng trong công nghiệp kháng sinh. Những chủng đầu tiên được sử dụng trong sản xuất chỉ đạt 10 – 15 đv/ml trong môi trường lên men bề mặt. Hiện nay, trong công nghiệp sản xuất penicillin bằng phương pháp lên men chìm, người ta chỉ sử dụng P. chrysogenum trong sản xuất công nghiệp.
5.1.2. Quá trình lên men
Quá trình lên men penicillin thuộc vào loại lên men hai pha: pha sinh trưởng và pha tạo sản phẩm penicillin. Nguồn carbon trong lên men penicillin bởi nấm P. chrysogenum có thể là glucose, saccharose, lactose, tinh bột, dextrin, các acid hữu cơ (lactic, acetic, formic), các amino acid... Tuy nhiên, đường lactose có hiệu suất penicillin cao nhất và thường được dùng trong công nghiệp. Nhưng do nấm sử dụng đường lactose chậm, vì vậy trong thực tế lactose được dùng phối hợp cùng với đường khác (glucose, saccharose...) trong môi trường dinh dưỡng.
Trong pha lên men thứ nhất giống phát triển mạnh, sử dụng glucose và acid lactic của cao ngô. Sau đó, lactose mới được sử dụng (chủ yếu trong pha thứ hai tạo thành penicillin). Khi trong môi trường cạn lactose và không bổ sung các chất dinh dưỡng hệ sợi nấm sẽ bắt đầu tự phân, nếu tiếp tục lên men nồng độ penicillin sẽ giảm, trong thực tế sản xuất cần phải kết thúc lên men trước thời điểm này.
Trong công nghiệp sản xuất penicillin dựa trên nấm mốc P. chrysogenumcó khả năng sinh penicillin cao, theo hai phương pháp:
- Lên men bề mặt: Phương pháp này được áp dụng trong thời gian đầu của công nghiệp kháng sinh. Môi trường nuôi cấy bề mặt có thể là các cơ chất rắn hoặc lỏng. Cơ chất rắn có thể là cám hoặc các loại hạt, cám được làm ướt rồi trải lên khay một lớp dày khoảng 2 cm, giống nấm mốc được trộn vào môi trường có độ ẩm 50 – 60% đã vô trùng để nguội tới 300C. Thời gian lên men 6 – 7 ngày ở 24 – 280C trong các buồng được điều chỉnh nhiệt độ, độ ẩm và thông gió. Nói chung, phương pháp này giống như lên men các enzyme bằng nấm mốc.
Môi trường lỏng dùng nguồn carbon là lactose, cao ngô và một số nguyên tố khoáng. Giống được cấy vào môi trường rồi lên men ở 240C khoảng 6 – 7 ngày. Ngày nay phương pháp lên men chìm đã thay thế phương pháp lên men bề mặt.
- Lên men chìm: Thành phần môi trường gồm có cao ngô, glucose, lactose và các muối khoáng. Giống dùng trong công nghiệp thường ở dạng bào tử. Bào tử được nuôi trên các thùng nhân giống có khuấy và sục khí 36 – 50 m3/giờ để hệ sợi nấm phát triển, sau đó chuyển vào các thùng lên men. Quá trình lên men penicillin bằng nấm mốc P. chrysogenumở 26 ± 10C trong khoảng 120 – 125 giờ.
Trong quá trình lên men ở pha thứ nhất nấm phát triển hệ sợi mạnh, sinh khối tăng nhanh, các nguồn carbon dễ đồng hóa (glucose, saccharose) cùng các nguồn nitrogen được tiêu hao nhanh, cường độ hô hấp tăng dần đến cực đại, pH tăng và penicillin được tạo thành ít. Sang pha thứ hai hệ sợi nấm phát triển chậm, lactose được tiêu hao dần, pH tăng đến khoảng 7 – 7,5 và penicillin được tạo thành chủ yếu trong pha này. Nếu nguồn carbon trong môi trường cạn và sinh khối nấm mốc bắt đầu tự phân thì pH có thể tăng tới 8 hoặc hơn, lượng penicillin được tạo thành trong môi trường sẽ giảm. Vì vậy, quá trình lên men cần được kết thúc trước thời điểm hệ sợi nấm mốc bắt đầu tự phân. Nấm mốc sinh penicillin rất hiếu khí, cho nên quá trình nuôi cấy (nhân giống và lên men) cần phải sục khí và khuấy môi trường để đảm bảo độ hòa tan O2 cân bằng với nhu cầu sinh lý của chúng. Nếu không đủ O2 hiệu suất penicillin có thể giảm tới hai lần.
Các phương pháp thu nhận và tinh chế penicillin: trích ly bằng dung môi hữu cơ, hấp thụ, trao đổi ion. Trong đó, phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ được sử dụng nhiều hơn cả. Phương pháp này dựa trên những đặc điểm là: muối của penicillin rất dễ hoà tan trong nước, acid penicillic rất dễ hoà tan trong dung môi hữu cơ. Quá trình này được thực hiện qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn thứ nhất: Trộn nước và dung môi để tăng bề mặt tiếp xúc. Làm như vậy để các phân tử kháng sinh tiếp xúc chặt chẽ với dung môi. Tiến hành khuấy liên tục để đảm bảo quá trình tiếp xúc này đạt mức độ cao nhất.
+ Giai đoạn thứ hai: Sau khi tiếp xúc giữa kháng sinh và dung môi sẽ tạo ra kết tủa. Để tách kết tủa khỏi dung dịch người ta tiến hành ly tâm.
5.2. Streptomycin
5.2.1. Tác nhân vi sinh
Năm 1944, Waksman và Schatz đã phát hiện ra streptomycin từ dịch nuôi cấy một chủng xạ khuẩn Streptomyces griseus(còn gọi là Actinomyces streptomycin).
Có khả năng đồng hóa mạnh các nguồn carbon như glucose, tinh bột, dextrin, fructose, galactose, mannose. Do đó người ta sử dụng tinh bột và glucose cho sản xuất streptomycin.
Streptomycin là một kháng sinh dùng phổ biến trong y học, thú y và bảo vệ thực vật.
5.2.2.Quá trình lên men
Sản xuất streptomycin chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy chìm, gồm hai pha: - Pha thứ nhất (pha sinh trưởng mạnh). Các bào tử nảy chồi và mọc thành sợi sau 6 – 8 giờ, mỗi bào tử mọc một chồi, khuẩn ty thường thẳng và phân nhánh rất yếu, tế bào chất ưa kiềm.
- Pha thứ hai (khuẩn ty không phát triển). Cuối ngày thứ ba sợi xạ khuẩn bị chia nhỏ và bắt đầu tự phân.
Những giống sinh streptomycin rất không ổn định. Do đó, trong tương lai cần có sự can thiệp của kỹ thuật di truyền để tạo ra những giống có hoạt lực cao và ổn định để
đưa vào sản xuất. Giữ bào tử ở dạng đông khô trong khoảng 5 năm có thể còn 96 – 99% hoạt lực, trong cát thạch anh tới 3 năm, trên môi trường thạch nước đậu ở 50C tới 1 năm.
Quá trình lên men này cũng giống như lên men các loại kháng sinh khác, bao gồm các giai đoạn: nhân giống, lên men chính, thu nhận chế phẩm thô, tinh chế sản phẩm.
- Nhân giống. Giống xạ khuẩn được bảo quản ở dạng bào tử. Cấy bào tử vào môi trường nhân giống trong bình tam giác lắc 180 – 220 vòng/phút ở 26 – 280
C/30 – 70 giờ, sau đó cho tiếp vào các nồi nhân giống (có sục khí và khuấy), nuôi tiếp cho phát triển sinh khối 20 – 40 giờ. Nhiệm vụ chính trong giai đoạn nhân giống là tạo ra một khối lượng lớn khuẩn ty xạ khuẩn ưa kiềm có khả năng phát triển mạnh trong giai đoạn lên men chính và tạo thành một lượng lớn kháng sinh.
- Lên men streptomycin là quá trình lên men hai pha điển hình. Nhiệt độ lên men khoảng 26 – 280C, thời gian lên men 96 giờ. Trong thời gian lên men cần phải thông khí và khuấy trộn môi trường. Lượng không khí thổi qua môi trường trung bình là 1 thể tích/1 thể tích môi trường. Khuấy môi trường liên tục trong suốt cả quá trình lên men (kể cả khi nhân giống) nếu ngừng khuấy chỉ trong một thời gian ngắn sẽ làm giảm hiệu suất streptomycin. pH trong những giờ đầu có giảm chút ít sau đó tăng dần.