- Môi trường bổ sun g2 (g/l):
3. BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT
1.1. Dinh dưỡng carbon
Carbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzyme, acid nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Do chiếm khoảng 50% trọng lượng chất khơ của tế bào, vì vậy carbon có ý nghĩa trong sự sống của sinh vật.
Nguồn carbon được vi sinh vật sử dụng là rất lớn. Ngồi những dạng carbon vơ cơ thuần khiết (kim cương, than chì) ra hầu như khơng có hợp chất carbon nào mà khơng được một nhóm vi sinh vật nhất định sử dụng.
Nguồn thức ăn carbon chủ yếu của vi sinh vật là carbonhydrate, đáp ứng được các yêu cầu của tế bào: sản sinh năng lượng; tạo thành những tiền chất; tạo ra các q trình ơxy hóa – khử để biến đổi tiền chất này thành những sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối cùng để xây dựng tế bào, đồng thời tích tụ trong mơi trường một hoặc vài sản phẩm sinh tổng hợp.
Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của các nguồn carbon phụ thuộc vào: + Thành phần và cấu tạo hóa học của chúng, đặc biệt là mức độ oxy hóa của các nguyên tử carbon.
+ Đặc điểm sinh lý của các vi sinh vật
Các hợp chất cao phân tử (tinh bột, protein,…) sẽ được thủy phân nhờ các enzyme thành các hợp chất phân tử thấp mà vi sinh vật có thể đồng hóa được. Đối với các hợp chất không tan trong nước (cellulose, lipid, paraffin) vi sinh vật hấp phụ quanh bề mặt của chúng và phân giải chúng dần dần.
Trong số carbonhydrate trước hết phải kể đến glucose là một nguồn carbon vạn năng đối với vi sinh vật. Quá trình biến đổi glucose trong tế bào vi sinh vật xảy ra theo 3 con đường: chu trình Embden – Meyerhof – Parnas (EMP); chu trình Pentose phosphate (PP) và chu trình Entner – Doudoroff (ED).
* Con đường EMP
Năm 1930, ba nhà khoa học người Đức là G. Embden, O. Meyerhof và Parnas đã tiến hành những phản ứng hóa học riêng rẽ trong hàng loạt các q trình lên men và xây dựng được con đường đường phân glucose. Sau này người ta gọi là chu trình Embden – Meyerhof - Parnas (EMP) hay chu trình đường phân (glucosis). Có thể chia con đường thành hai giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu: giai đoạn “đầu tư năng lượng” bao gồm 5 phản ứng đầu tiên. Ở giai đoạn này đường được hoạt hóa bởi ATP từ phản ứng phosphoryl hóa, để tạo fructose -1,6 diphosphate. Đường này sau đó được cắt thành hai phân tử triose phosphate.
+ Giai đoạn sau: là giai đoạn “phát sinh năng lượng” bao gồm 5 phản ứng tiếp theo. Ở giai đoạn này các triose – phosphate sẽ được hoạt hóa tiếp để tạo thành hai hợp chất chứa các liên kết phosphate cao năng là 1,3 - diphosphoglycerate và phosphoenolpyruvate. Hai chất này sẽ chuyển phosphate cao năng ADP để tạo thành ATP.
Từ glucose qua con đường EMP tạo thành 2 ATP, hiệu suất của con đường này khoảng 51%.
*Con đường Hexomonophosphate (HMP)
ĐượcO. Warburg, F. Dickens, B.S. Horecker và E. Racker khám phá vào những năm 1940-1950, còn được gọi là con đường Pentose phosphate (PP). Đặc trưng của con đường này là tạo ra NADP-H (nicotineamide adenine dinucleotide phosphate), kết quả từ một phân tử glucose tạo thành 1 ATP, gồm hai giai đoạn chuyển hóa:
+ Giai đoạn oxy hóa: gồm 3 phản ứng, các phản ứng này đều là quá trình khử NADP+ thành NADH. Phản ứng đầu tiên có sự tham gia của enzyme glucose – 6 – phosphate dehydrogenase. Khi đó glucose – 6 – phosphate (G6P) sẽ bị oxy hóa thành lacton, tiếp tục bị thủy phân nhờ enzyme lactonase đặc hiệu để tạo thành 6 phosphogluconate (6 –PG), 6-PG tiếp tục bị ơxy hóa tạo thành NADPH và pentose.
+ Giai đoạn khơng oxy hóa: ribulose-5-phosphate tiếp tục được chuyển hóa để tạo thành ribose 5 phosphate (Ri -5- P) nhờ enzyme phospho-pentose-isomerase.
*Con đường Entner – Doudoroff (ED):
Là con đường phân giải hexose này được khám phá lần đầu tiên ở vi khuẩn
Pseudomonas saccharophila. Sản phẩm đặc trưng cho quá trình này là 2 keto-3 deoxy- 6 phosphogluconat, nên còn được gọi là con đường KDPG.
Con đường ED được một số ít vi sinh vật sử dụng, chủ yếu là chi Pseudomonas.
Mỗi phân tử glucose qua con đường ED chỉ tạo ra được 1 ATP, vì vậy hiệu suất năng lượng của con đường này cũng vào khoảng 25%.
Như vậy, từ glucose qua các con đường EMP hoặc PP hoặc ED các vi sinh vật chỉ thu được rất ít năng lượng 1-2ATP, phần năng lượng chủ yếu vẫn cịn tích lũy trong các NADH, NADPH, và nhất là trong pyruvate. Đặc biệt từ glucose đến pyruvate, mới chỉ có một mối liên kết carbon (C-C) được cắt ra.
Trong q trình oxy hóa hồn tồn, pyruvic acid tạo được từ các con đường trên được các vi sinh vật hơ hấp hiếu khí sử dụng triệt để thơng qua chu trình tricarbocylic acid (TCA) hay cịn gọi là chu trình Krebs.
Tùy thuộc vào hệ enzyme của vi sinh vật, nếu ở vi sinh vật hiếu khí bắt buộc thực hiện q trình oxy hóa hồn tồn thì hợp chất 3 carbon này sẽ được oxy hóa đến cùng để tạo ra CO2 và H2O thơng qua chu trình TCA. Trong trường hợp oxy hóa khơng hồn tồn, các vi sinh vật cũng tiến hành hơ hấp hiếu khí nhưng sản phẩm tiết ra mơi trường là những chất hữu cơ chỉ được oxy hóa một phần như các cetoacid, acetic acid, gluconic acid, fumaric acid¸ citric acid, lactic acid và hàng loạt các hợp chất hữu cơ khác. Các sản phẩm này giống với sản phẩm của một số quá trình lên men như lên men propionic, butyric, lactic… nên còn được gọi là “lên men oxy hóa”.
Một phần năng lượng có thể thu được từ sự phân giải glucose thành pyruvate qua các con đường nói trên nhưng phần lớn năng lượng lại được giải phóng khi pyruvate bị phân giải hiếu khí thành CO2 trong chu trình TCA. Dựa vào số lượng C của các chất trung gian có thể chia chu trình TCA làm 3 giai đoạn:
- Phức hợp đa enzyme pyruvate dehydrogenase thực hiện q trình oxy hố pyruvate thành CO2 và acetyl – CoA, là một phân tử cao năng bao gồm coenzyme A và acetic acid nối với nhau qua liên kết cao năng thioester.
Acetyl – CoA xuất hiện từ sự phân giải của các chất khác nhau như carbonhydrate, lipid và các amino acid có thể bị phân giải tiếp trong chu trình này. Cơ chất đối với chu trình TCA là acetyl-CoA.
- Sự kết hợp acetyl-CoA với oxaloacetate (chất trung gian 4C) thành citrat và mở đầu chặng 6C. Citrat (chứa 3 gốc COOH) được sắp xếp lại tạo thành isocitrat. Sau đó isocitrat bị oxy hóa và loại carboxyl hai lần tạo ra - ketoglutarat rồi succinyl-CoA. Ở giai đoạn này 2NADH được tạo thành và 2C bị tách khỏi chu trình như CO2.
- Giai đoạn 4C trong đó qua hai bước oxy hóa xuất hiện một FADH2 và một NADH. Ngồi ra, GTP (một phân tử cao năng tương đương ATP) được tạo thành từ succinyl – CoA nhờ phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất. Cuối cùng oxaloacetat được tái tạo và sẵn sàng kết hợp với một phân tử acetyl – CoA khác. Từ hình 3.4. nhận thấy chu trình TCA tạo ra 2 CO2, 3 NADH, 1 FADH2và 1GTP đối với mỗi phân tử acetyl-CoA bị oxy hoá.
Trong cơng nghiệp lên men nói chung, trừ trường hợp thu nhận sinh khối đơn thuần, người ta cố tạo điều kiện cho vi sinh vật có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon để tổng hợp các sản phẩm cần thiết nhiều hơn so với việc tăng sinh khối và tạo thành CO2.
Tế bào vi sinh vật Các quá trình ngoại bào
Tinh bột Glucose
Các enzyme Maltose
α, β - amylase
Các quá trình nội bào
Các enzyme Glucose α - glucosidase CO2, rượu và các sản phẩm trao đổi chất kỵ khí khác CO2, rượu và các sản phẩm trao đổi chất hiếu khí khác 39
Cơ chất dinh dưỡng làm nguồn carbon trong quá trình trao đổi chất và trong lên men là các loại đường saccharose, maltose, lactose, glucose, các đường hexose khác và các loại ngũ cốc. Khơng phải tất cả các vi sinh vật đều có thể sử dụng được các nguồn carbon này, chỉ có các tế bào vi sinh vật hệ enzyme chuyển hóa chúng thành glucose mới có thể đồng hóa. Có một số lồi có hệ enzyme chuyển hóa các paraffin của dầu mỏ, các dạng khí đốt như methane làm nguồn dinh dưỡng carbon.