, NO3− peptone các amino acid (sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm).
3. BẢO VỆ QUÁ TRÌNH LÊN MEN
Muốn cho quá trình lên men được kết quả, ta cần phải tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chủng vi sinh vật nuôi cấy được phát triển và hoạt động tối ưu. Muốn vậy, trước tiên phải ngăn cản sự xâm nhập và phát triển của các vi sinh vật lạ. Trong nhiều quá trình lên men thì cần phải vô trùng. Muốn có điều kiện nuôi cấy vô trùng phải tiến
hành thanh trùng môi trường, thiết bị và toàn bộ hệ thống van, đường ống, các thiết bị phụ trợ trong dây chuyền sản xuất.
3.1. Khử trùng thiết bị và hệ thống đường ống truyền dẫn (hệ thống CIP)
Môi trường, thiết bị và hệ thống ống truyền dẫn phần lớn được khử trùng bằng hơi ở nhiệt độ 105 – 1200C với áp suất dư 0,05 – 0,1 MPa. Mặt bàn để cấy giống, các miệng bình nhân giống đều phải tráng rửa bằng cồn.
Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt cần phải khử trùng thiết bị, dụng cụ có liên quan đến giống vi sinh vật (thùng nuôi cấy, khay, thùng chứa nước, thùng chuẩn bị dịch huyền phù giống... Các thiết bị này có thể dùng các dịch sát khuẩn để ngâm hoặc lau rửa, xông SO2hoặc đem sấy ở nhiệt độ cao ở 1600C ít nhất là 1 giờ.
Trong phương pháp lên men bề sâu việc khử trùng thiết bị và hệ thống ống truyền dẫn là vô cùng quan trọng. Nếu công việc này không được tiến hành nghiêm ngặt thì quá trình lên men sẽ hoàn toàn bị phá hỏng, không thu được kết quả gì. Khử trùng nồi lên men và hệ thống ống truyền dẫn ở 1200C và làm nguội tới 60 – 800
C thì cho môi trường vào. Riêng đường ống dẫn dầu phá bọt cần phải khử trùng ở 125 – 1350
C trong 1,5 – 2 giờ. Sau khi nồi lên men đã có môi trường, kiểm tra độ kín và thử cánh khuấy thì cho tiến hành khử trùng môi trường cùng với thiết bị.
Hình 4.2. Hệ thống van, đường ống truyền dẫn
Ngoài ra, các bộ phận, dụng cụ để tiếp giống, tiếp thêm chất dinh dưỡng, chất điều chỉnh pH...đều phải khử trùng. Các đoạn đường ống có van chặn cần phải thêm van đuôi, khi thanh trùng mở van đuôi cho hơi vào các khe và xả nước ngưng. Các đầu ống lấy mẫu, ống tiếp dịch cần phải có chụp bảo vệ không để tiếp xúc với không khí bên ngoài và trước khi sử dụng đều phải khử trùng đầu ống. Vấn đề vệ sinh và khử trùng nhà xưởng phải được kiểm soát thường xuyên.
3.2. Khử trùng môi trường nuôi cấy bề mặt
Môi trường nuôi cấy bề mặt thường là các hợp chất rắn, xốp, gồm cám, bột và các chất dinh dưỡng. Trong sản xuất công nghiệp môi trường này thường được khử trùng bằng hơi nóng trong thiết bị chuyên dùng với áp suất dư 0,05 MPa để đạt được nhiệt độ 104 – 1100C. Để tăng hiệu quả khử trùng người ta cho vào môi trường trước khi gia nhiệt một chất kháng sinh là furaxine với tỉ lệ 1,5g cho 100g môi trường hoặc dung dịch formaline 40% với tỉ lệ 0,2% trong nước làm ẩm môi trường. Ngoài ra, người ta còn điều chỉnh pH môi trường thích hợp bằng acid chlohydric, acid sulfuric hoặc acid lactic.
Khử trùng bằng hơi nóng có thể qua hai giai đoạn:
+ Nâng nhiệt độ tới 1000C và đảo khối môi trường liên tục trong 15 – 20 phút. + Sau đó nâng nhiệt tới 1100C trong khoảng 60 – 90 phút và cứ 15 phút lại đảo môi trường 3 – 5 phút.
Môi trường sau khi khử trùng chia vào các khay coi như môi trường vô trùng, được làm nguội và được tiếp giống cho vào lên men.
3.3. Khử trùng môi trường nuôi cấy bề sâu
Khử trùng môi trường nuôi cấy bề sâu (môi trường lỏng) có thể thực hiện theo phương pháp gián đoạn hoặc liên tục.
Phương pháp gián đoạn: thường dùng trong trường hợp khối dịch môi trường không lớn, như dịch dùng trong các bình lên men thí nghiệm, các nồi nhân giống và ở các nồi lên men không quá lớn. Tiến hành lên men từng mẻ ngay ở trong thiết bị theo nguyên lý thiết bị hấp áp lực qua một số giai đoạn sau:
+ Khử trùng thiết bị lên men và hệ thống đường ống tiếp xúc với môi trường bằng hơi nóng trực tiếp hoặc gián tiếp.
+ Cho dịch môi trường đã pha chế vào thiết bị (lượng dịch bằng 3/4 thể tích của thiết bị và phải tính thêm phần nước ngưng khi cho hơi trực tiếp vào môi trường).
+ Gia nhiệt tới nhiệt độ thanh trùng. Có hai bước gia nhiệt: cho hơi vào vỏ thiết bị hoặc ống xoắn trao đổi nhiệt khi dịch tới gần 1000C thì cho hơi vào thiết bị trực tiếp với dịch để nâng nhiệt độ tới nhiệt độ tới hạn.
+ Giữ ở nhiệt độ này trong khoảng thời gian thanh trùng cần thiết.
+ Làm nguội dịch ở ngay trong thiết bị bằng cách cho nước vào vỏ hoặc ống xoắn trao đổi nhiệt cùng với hệ thống khuấy làm việc.
Để tránh biến đổi trong thành phần dinh dưỡng của môi trường nên chỉ tiến hành ở áp suất dư 0,05 – 0,1 MPa với nhiệt độ 110 – 1200C trong khoảng 1 – 1,5 giờ từ lúc đạt được nhiệt tới hạn.
Ưu điểm của phương pháp này là tránh được tạp nhiễm do môi trường không phải vận chuyển. Nhưng nhược điểm là thời gian kéo dài. Hiện nay, để rút ngắn thời gian lên men người ta dùng một thiết bị riêng để thanh trùng.
Phương pháp liên tục: tiến hành ở nhiệt độ cao hơn (140 – 1450C ) và giữ ở thời gian ngắn hơn 5 – 15 phút ở nhiệt độ này, phương pháp này cho phép đảm bảo an toàn tốt nhất và không làm thay đổi thành phần của môi trường. Thiết bị dùng vào việc này có 3 bộ phận: bộ phận khử khuẩn là cột được gia nhiệt bằng hơi khi môi trường lỏng chảy qua, bộ phận tiếp theo là bình giữ dịch ở nhiệt độ xác định trong khoảng thời gian gần bằng thời gian để diệt tối đa số vi sinh vật. Phần thiết bị này có thể là thùng hình trụ hoặc cột có các vách ngăn hoặc các tầng đĩa để phân tán nhiệt cho đồng đều cả khối môi trường hoặc ở dạng ống xoắn trao đổi nhiệt. Bộ phận giữ môi trường và giữ nhiệt này làm việc ở áp suất dư. Phần thứ ba là bộ phận làm nguội dịch môi trường có hệ trao đổi nhiệt với nước làm việc với áp suất dư 0,03 – 0,05 MPa. Thường bộ phận này được cấu tạo theo kiểu ống lồng ống.
3.4. Khử trùng dầu mỡ phá bọt
Các chất phá bọt thường là dầu thực vật, các hợp chất hoạt động bề mặt... Vì các tế bào vi khuẩn ở trong những chất này có độ bền nhiệt cao gấp 2 – 3 lần so với ở trong nước, nên việc thanh trùng cần phải thận trọng. Công việc này được tiến hành trong một thiết bị riêng ở gần thiết bị lên men và theo phương pháp khử trùng gián đoạn với áp suất dư của hơi là 0,2 – 0,25 MPa. Hơi được dẫn qua vỏ kép hoặc ống xoắn ruột gà. Nhiệt độ khử trùng là 120 – 1250C trong khoảng 1 – 1,5 giờ. Dầu và bình chứa dầu sau khi khử trùng làm nguội được giữ ở điều kiện áp suất dư 0,03 – 0,04 MPa bằng khí nén vô trùng. Khi phá bọt dùng khí nén vô trùng đẩy qua hệ thống van đường ống nối với nồi lên men.
3.5. Khử trùng không khí
Cung cấp khí sạch cho nuôi cấy bề mặt: là một bộ phận đặt những máy điều hoà và làm sạch không khí thường ở trên hoặc bên cạnh phòng nuôi cấy. Quá trình làm sạch qua các giai đoạn:
+ Không khí qua lọc sơ bộ để loại các bụi bẩn cơ học và phần lớn các vi sinh vật + Vào điều hoà tổng có điều chỉnh nhiệt (nếu cần)
+ Vào quạt chung + Lọc vi sinh vật
+ Cung cấp cho các máy điều hoà riêng, rồi cấp cho buồng nuôi cấy.
Trong các xí nghiệp sản xuất vi sinh theo phương pháp bề mặt với quy mô lớn người ta thiết kế bộ phận này sử dụng được khí tuần hoàn, không khí được cấp qua phòng nuôi cấy được đưa lại các máy điều hoà riêng tới 90%, chỉ bay ra khí quyển khoảng 10%.
Cung cấp khí sạch cho nuôi cấy chìm: là cả hệ thống tương đối phức tạp và qua các giai đoạn sau:
Lọc sơ bộ được cấu tạo bởi hai lớp lưới thép inox đặt ở mặt trước và mặt sau hộp chữ nhật hoặc hình trụ. Giữa hai tấm lưới lọc này được xếp đầy các mảnh sứ hoặc các vòng kim loại. Các mảnh sứ hoặc các vòng kim loại được tẩm dầu nhờn để các loại bụi dễ bám vào đó.
Không khí sau khi nén bị nóng cần làm nguội qua bình trao đổi nhiệt bằng nước, sau đó đưa qua bình nhỏ để tách những giọt dầu do khí nén cuốn theo và những hạt nước ngưng do làm nguội khí. Không khí nén được chứa vào bình lớn với áp suất trung bình 6 ÷8 atm và sau đó đưa vào phin lọc chung (tổng lọc) rồi chia làm các phin
Tách dầu nước
Thiết bị lên men Buồng nuôi cấy vô trùng Lọc sơ bộ Qua cột hút Không khí Làm nguội Nén khí Lọc riêng Lọc chung Hình 4.3. Sơ đồ lọc không khí
hình trụ có hai vỏ, bên trong được xếp vật liệu lọc bằng bông thuỷ tinh, bông mỡ, vải, amianthus, tấm lọc từ các loại sợi đặc biệt...
Không khí sạch vô trùng được đưa vào thiết bị lên men qua các bộ phận phun tia kết hợp với khuấy đảo hoặc ống hồi lưu để tăng thêm độ hoà tan của oxygen vào dịch, nhằm cung cấp tối đa nhu cầu oxygen của chủng nuôi cấy để đạt được năng suất lên men cũng như hiệu suất chuyển hoá cao.
3.6. Kiểm tra an toàn vệ sinh (trạng thái vô trùng)
Kiểm tra trạng thái vô trùng của môi trường cũng như cả hệ thống thiết bị trước khi bắt đầu và trong quá trình lên men, đặc biệt là pha sinh trưởng là việc rất cần thiết.
Trong lên men bề mặt: cần kiểm tra vô trùng môi trường sau khi khử trùng và nước làm ẩm bổ sung vào môi trường. Lấy mẫu và cấy vào các hộp petri có môi trường thạch - thịt - peptone hoặc thạch - malt. Sau đó gói hộp bằng giấy sạch và để vào tủ ấm 30 ÷ 370C trong 24 giờ, đọc kết quả.
Trong lên men chìm: kiểm tra môi trường sau khi khử trùng, trước lúc tiếp giống, sau khi tiếp giống và sau khoảng 4 ÷ 5 giờ lại lấy mẫu kiểm tra, mẫu lấy được đựng trong các bình vô trùng. Nếu môi trường sau khi khử trùng, trước lúc tiếp giống thì chia vào các bình tam giác đặt trên máy lắc 30 ÷ 370C trong 24 ÷ 36 giờ, sau khi tiếp giống thì được cấy trên môi trường thịt - peptone trong ống nghiệm và để trong tủ ấm 30 ÷ 370C trong 24 ÷36 giờ. Đọc kết quả và đánh giá trạng thái của môi trường cũng như quá trình. Trong trường hợp đọc kết quả của môi trường đã tiếp giống và đang lên men thấy chủng nuôi cấy không phát triển hoặc bị giảm độ đục thì phải lấy mẫu cấy trên môi trường thạch - thịt - peptone. Nếu thấy trên mặt khuẩn lạc của chủng nuôi cấy có những vết trống, chứng tỏ các tế bào bị dung giải, quá trình có thể bị nhiễm thực khuẩn thể, cần kiểm tra lại hoặc đối chiếu vào hiện trạng lên men sẽ cho ta kết quả chính xác.
Từ kết quả kiểm tra vô trùng chúng ta mới yên tâm cho quá trình tiếp tục hoặc phải xử lý. Nói chung, trong quá trình lên men chìm người ta cố gắng làm sao cho cả quá trình làm việc trong trạng thái vô trùng.