- Sự tạo thành ester: Cùng với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme esterase của nấm men, các acid và alcol tác dụng với nhau tạo ra các ester
5. SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU VI SINH VẬT 1 Định nghĩa
5.2.1. Thuốc trừ sâu vi sinh sản xuất từ vi khuẩn
Vi khuẩn có quan hệ với côn trùng rất đa dạng và được chia thành 2 nhóm: Vi khuẩn hình thành bào tử gồm tất cả vi khuẩn gây bệnh bắt buộc và các loài gây bệnh không bắt buộc. Phần lớn các loài gây bệnh không bắt buộc có tinh thể độc; Vi khuẩn không hình thành bào tử bao gồm một loài gây bệnh hoàn toàn không bắt buộc và tất cả những loài vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh cho côn trùng
Vi khuẩn gây bệnh bắt buộc là vi khuẩn luôn liên quan với một loại bệnh nhất định ở côn trùng. Trong tự nhiên, vi khuẩn gây bệnh bắt buộc thường chỉ thích nghi với một phổ ký chủ hẹp.
Vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc có thể làm tổn hại hoặc xâm nhiễm vào những mô của cơ thể côn trùng mẫn cảm với chúng, nhưng không thể xếp chúng vào nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc. Trước khi xâm nhập vào xoang máu vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc thường sinh sản trong ruột côn trùng.
Vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh, bình thường không sinh sản ở trong ruột côn trùng, nhưng chúng có thể xâm nhập vào xoang máu. Những vi khuẩn này phát triển được trên môi trường thức ăn nhân tạo, không chuyên tính với từng nhóm côn trùng riêng biệt.
Vi khuẩn sử dụng trong biện pháp sinh học trừ dịch hại thuộc bộ Eubacteriales, đặc biệt là thuộc họ Enterobacteriaceae, Microccaceae, Bacillaceae và một số giống thuộc họ Pseudomonadeceae (bộ Pseudomonadales).
Họ Pseudomonadeceae gồm các loại vi khuẩn hình que, Gram âm, không hình thành bào tử. Các loài Pseudomonas aeruginosa, P. chlororaphis, P. fluorescens,... là những vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh cho côn trùng.
Họ Enterobacteriaceae gồm các loài vi khuẩn sống ở ruột côn trùng. Chúng có dạng hình que, Gram âm, không hình thành bào tử. Phát triển tốt trên môi trường dinh dưỡng bình thường. Vi khuẩn thuộc họ này có loài là ký sinh bắt buộc, không bắt buộc và hoại sinh.
Họ Bacillaceae gồm vi khuẩn hình thành bào tử, Gram dương, hình que. Có ý nghĩa trong biện pháp sinh học là các loài thuộc giống Bacillus, Clostridium.
* Một số vi khuẩn được ứng dụng trong phòng chống côn trùng
- Vi khuẩn Coccobacillus acridiorum
Đây là vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng đầu tiên được D' Herelle nghiên cứu và mô tả vào năm 1911 tại Mexico. Vi khuẩn có dạng hình que nhỏ, Gram âm và được gọi tên ban đầu là C. acridiorum gây bệnh nhiễm trùng máu cho châu chấu, có thể phát triển trên môi trường nhân tạo. Sản phẩm từ vi khuẩn Coccobacillus acridiorum được áp dụng tương đối thành công ở Mexico, Colombia, Argentia. Theo hệ thống phân loại hiện đại vi khuẩn có thể là loài Enterobacter cloacae var. acridiorum.
- Vi khuẩn gây bệnh sữa cho ấu trùng bọ hung
Bệnh sữa được phát hiện đầu tiên ở ấu trùng bọ hung ở Nhật Bản Popillia japonica từ năm 1921 gồm 2 dạng cơ bản là dạng A và B. Vi khuẩn gây nên 2 dạng bệnh này được mô tả với tên Bacillus popolliae (dạng bệnh A) và B. lentimormus
(dạng bệnh B). Trong 2 loài vi khuẩn này thì loài B. popolliae phổ biến hơn chiếm 88% trường hợp và được chú ý nghiên cứu hơn. Loài B. popolliae là vi khuẩn ký sinh bắt buộc, Gram dương; bào tử có tính kháng cao với các điều kiện bất lợi của môi trường, lây nhiễm bệnh cho bọ hung qua đường tiêu hoá. Sau khi xâm nhập vào vật chủ 3 – 4 ngày thì vi khuẩn bắt đầu sinh bào tử, tới ngày thứ 13 – 16 thì bào tử của vi khuẩn đạt tới mức tối đa. Trên môi trường thức ăn nhân tạo vi khuẩn không hình thành bào tử, vì vậy phải nuôi nhân vi khuẩn này trên ấu trùng bọ hung Nhật Bản. Sau 20 ngày ủ bệnh, một ấu trùng bọ hung Nhật Bản tích lũy tới 20 tỷ bào tử. Từ các sâu bị bệnh có thể gom vi khuẩn và sản xuất thành chế phẩm dạng bột chứa 100 triệu bào tử trong 1 gam chế phẩm.
- Vi khuẩn Serratia marcescens
Đây là một vi khuẩn hình que, Gram âm, không hình thành bào tử, ký sinh không bắt buộc trên côn trùng. Tính gây bệnh cho côn trùng của vi khuẩn này được ghi nhận trong tài liệu từ năm 1886 (Masera, 1936). Vi khuẩn S. marcescens đã gây dịch cho bọ hung Melolontha melolontha, tằm và được sử dụng thành công trừ sâu đục thân ngô. Vi khuẩn có tính gây bệnh cao cho châu chấu Melanoplus bivittatus, một số rệp sáp
Pseudococcus, sâu non Pieris brassicae, Lymantria dispar, Euproctis chrysorrhoea, Agrotis segertum, bọ xít Eurygaster...
- Vi khuẩn Bacillus cereus
Là vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, Gram dương, hình thành bào tử nhưng không tạo thành tinh thể độc. Tính gây bệnh cho côn trùng của vi khuẩn này rất khác nhau. Người ta cho rằng tính gây bệnh của B.cereus chủ yếu liên quan tới sự tạo thành men phospholipase và một loại ngoại độc tố như của Bacillus thuringiensis.
- Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)
Là trực khuẩn sinh bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc, bắt màu thuốc nhuộm Gram dương, kích thước 3 – 6µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ hay xếp thành từng chuỗi. Bacillus thuringiensis không lên men sinh acid đối với arabinose, cilose và maltose, khử NO3
-
thành NO2-, có phản ứng với lòng đỏ trứng, phát triển trên môi trường thạch kỵ khí và trên môi trường chứa 0,001% lizozym
Bacillus thuringiensischứa tinh thể độc có bản chất protein, có khả năng diệt sâu. Nhiệt độ sinh trưởng tối đa Bt là 40 – 45oC, tối thiểu 15 – 45oC, tối ưu 29 – 30o
C. Bào tử Bt có dạng hình ovan, hình trứng dài 1,2 – 1,6 µm, có thể nảy mầm tế bào sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi. Tinh thể protein được gọi là “thể kèm bào tử”, hình trám tám mặt, có kích thước khoảng 0,6 x 2µm.
+ Các loại độc tố của Bt: có 4 loại
· Ngoại độc tố α (α-exotoxin) hay là phospholipase C, tác động của enzyme này có liên quan đến sự phân hủy mang tính cảnh ứng của phospholipid trong mô của côn trùng làm cho côn trùng bị chết (Krulov & Manakov, 1987).
· Ngoại độc tố β (β-exotoxin) hay là loại độc tố bền nhiệt. Ngoại độc tố này ở nhiệt độ 120 – 1210
C trong 10-15 phút vẫn còn hoạt tính. Một số Bt không sinh tinh thể độc nhưng có thể sinh β-exotoxin. Hoạt tính của β-exotoxin bắt đầu xuất hiện trong giai đoạn vi khuẩn phát triển mạnh, trước khi hình thành bào tử. Tác động của nó là kìm hãm nucleotid và DNA – polymerase phụ thuộc DNA, các enzyme này gắn với ATP dẫn đến việc ngưng tổng hợp RNA. Ngoại độc tố β - exotoxin còn tác dụng cộng hưởng với nội độc tố δ-endotoxin, sau khi nội độc tố δ - endotoxin có tác dụng gây dập vỡ, phá hủy hoàn toàn biểu mô ruột giữa của côn trùng mẫn cảm, ngoại độc tố β - exotoxin đã nhanh chóng xâm nhập vào huyết tương và máu đến các cơ quan gây thay đổi sinh lý và dẫn đến cái chết nhanh chóng đối với ấu trùng.
Ngoại độc tố β - exotoxin rất hiệu quả trong việc phòng trừ sâu non của các loài côn trùng mẫn cảm. Gây ra những trì trệ trong việc chuyển hóa lột xác của sâu hại và có tác động đối với cả con trưởng thành được phát triển từ các ấu trùng ăn phải độc tố dưới ngưỡng.
· Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin) hay còn gọi là độc tố tan trong nước. Độc tố có chứa các peptid với khối lượng phân tử thấp (200 – 2000) và một số amino acid tự do. Độc tố này tana trong nước, không ổn định, mẫn cảm với không khí, ánh sáng, ôxy và nhiệt độ (bị mất hoạt lực từ 600C trở lên trong vòng 10 – 15 phút). Độc tố này thuộc nhóm phospholipase tác động lên phospholipid và giải phóng ra acid béo, làm phá huỷ các mô tế bào của sâu hại khi bị nhiễm Bt.
· Nội độc tố δ (δ - endotoxin) hay còn gọi là tinh thể độc. Là một protein kết tinh gồm 1180 amino acid. Các amino acid chủ yếu là glutamic, asparaginic, chiếm trên 20% tổng số amino acid trong phân tử và là nguyên nhân gây điểm đẳng điện thấp. Lượng amino acid cystine chiếm thấp nhất < 2% tổng số amino acid, quy định sự không hòa tan của tinh thể. Ngoài protein, tinh thể còn chứa các thành phần khác như carbonhydrate (5,6%); các nguyên tố như Ca, Mg, Fe, Si… và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn…, hầu như không có P.
+ Đặc điểm của tinh thể độc: Tinh thể độc của Bt có dạng hình thoi hoặc hình quả trám mang chất protein và có độc tính cao với nhiều loại côn trùng. Kích thước của tinh thể 1µm x 0,5µm, chiếm 30% trọng lượng khô của tế bào. Tinh thể độc rất bền vững với nhiệt độ, có khối lượng phân tử là 5.000, không phải bào tử nào cũng chứa tinh thể độc.
+ Cấu tạo của tinh thể độc: gồm 3 vùng chức năng
· Vùng I là một bó gồm 7 chuỗi xoắn α. Một vài hoặc tất cả các chuỗi có thể cài vào màng tế bào ruột, tạo ra các lỗ, từ đó các ion có thể qua lại tự do.
· Vùng II chứa 3 dải β không song song tương tự như vùng gắn kháng nguyên của globulin miễn dịch. Vùng này có vai trò gắn với thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô ruột.
· Vùng III có nhiệm vụ bảo vệ độc tố đã được hoạt hóa không bị phân huỷ bởi protease ở ruột.
+ Tác động của tinh thể độc: Có khả năng diệt các loài sâu hại cây trồng, chủ yếu là các loại sâu non thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera; mọt hại kho nông sản, bộ cánh cứng Coleoptera; và các loài cung quăng, ấu trùng của muỗi thuộc bộ hai cánh
Diptera.
Trong 4 độc tố trên quan trọng nhất là nội độc tố δ - endotoxin vì nó quyết định hoạt tính diệt côn trùng của Bt. Hiện nay, trên thế giới còn có khả chế tạo và nghiên cứu sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt tổng hợp, hoặc hai tổng hợp hai chủng Bt với nhau, hoặc tổng hợp Bt với thuốc trừ sâu virus để làm tăng hiệu quả trừ sâu theo cơ chế đồng tác động.
+ Chu trình sống và cơ chế lây nhiễm độc của Bt
Chu trình sống của vi khuẩn Bt chia ra ba giai đoạn: thể sinh dưỡng, nang bào tử, bào tử và tinh thể:
· Thể sinh dưỡng
Thể sinh dưỡng dạng que, kích thước 1,2 – 1,8µm x 3 – 5µm, bắt màu Gram dương. Lông mọc xung quanh hơi động hoặc không động. Chúng thường tồn tại một cá thể hoặc hai cá thể liền nhau. Thể dinh dưỡng sinh sản theo kiểu phân chia ngang. Trong thời kỳ sinh sản thường có 2, 4, 8… thể dinh dưỡng liền nhau thành chuỗi. Lúc này vi khuẩn sinh trưởng nhanh, trao đổi chất nhiều dễ nuôi cấy trên môi trường.
· Nang bào tử
Khi vi khuẩn già, một trong hai đầu trong cơ thể hình thành bào tử hình bầu dục, còn đầu kia hình thành thể hình thoi. Đó là giai đoạn nang bào tử, ở giai đoạn này nang bào tử hình trứng dài, to hơn thể sinh dưỡng.
· Bào tử và tinh thể
Khi nang bào tử phát triển đến một giai đoạn nào đó, chúng sẽ nứt ra, giải phóng bào tử và tinh thể. Kích thước bào tử 0,8-0,9µm x 2µm. Bào tử ở dạng ngủ có thể đề kháng với các điều kiện môi trường bất lợi. Chế phẩm vi khuẩn thường được bảo quản ở dạng bào tử. Tinh thể thường có kích thước thay đổi khoảng 0,6 x 2µm, hình thoi, cũng có loại hình tròn, hình bầu dục tùy theo loài và loại môi trường. Tinh thể là một loại protein (chất diệt sâu) có hiệu quả chủ yếu.
Cơ chế gây độc của tinh thể độc cùng với bào tử xâm nhập vào cơ thể sâu bằng con đường tiêu hoá khi sâu ăn phải lá có vi khuẩn. Trong điều kiện bình thường, tinh thể độc không hòa tan. Khi đi vào ruột giữa của sâu, nơi có pH kiềm cao (>9,5) làm cho tinh thể độc tan ra. Tuy nhiên dạng hòa tan này chưa phải dạng hoạt động. Dạng tiền độc tố (có kích thước từ 135 – 140 kDa) này được protease trong ruột giữa của sâu hoạt hóa thành dạng hoạt tính (60 – 66 kDa) độc tố δ. Độc tố này liên kết với tế bào mô thành ruột, đâm qua màng tạo thành lỗ xuyên màng, làm mất cân bằng ion nội bào của tế bào biểu mô và làm chúng bị phân giải, sâu ngừng ăn và bị chết đói, pH trong ruột bị giảm xuống bằng với pH nội môi trong huyết tương. Độ pH thấp cho phép bào tử nảy mầm, xâm nhập vật chủ và cuối cùng gây chết.
* Quy trình sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu Bt
- Nguyên liệu
+ Nguồn carbon là tinh bột, maltose, glucose. Nếu là tinh bột thường dùng là gạo, ngô, sắn ,….Tinh bột qua giai đoạn thủy phân tạo đường đơn và đường đôi sử dụng amylase hoặc H2SO4 trong điều kiện nhiệt độ cao để thủy phân.
+ Nguồn N: thường sử dụng là bột cá, bột ngô, bột bánh lạc, bột bánh đậu, cao thịt bò, peptone, bột men,….
+ Muối vô cơ thường bổ sung vào là các muối sau: K2HPO4, MgSO4,,CaCO3
Môi trường sau khi trộn lẫn các thành phần trên trải qua giai đoạn dịch hóa Sau khi chuẩn bị môi trường xong nên đi khử trùng với các chế độ khử trùng sau: Khử trùng bằng phương pháp gián đoạn: tiến hành ở áp suất dư 0,05 – 0,1Mpa với nhiệt độ từ 110 – 1200
C trong vòng 1 – 1,5 giờ; hoặc khử trùng liên tục: tiến hành ở nhiệt độ cao hơn 140 – 1450
C và thời gian ngắn hơn 5 – 15 phút.
- Lên men: Tiến hành trong nồi lên men có dung tích 500l, 1000l, 2000l , ở điều kiện nhiệt độ từ 27 – 320C điều chỉnh pH 7,5 trong khoảng thời gian từ 48 – 72giờ. Trong quá trình lên men tiến hành thổi khí.
- Chế độ thổi khí: Đây là chỉ tiêu cho quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc. Ngưỡng thổi khí tốt nhất trong quá trình lên men là 0,5 – 0,6m3 môi trường/m3
không khí. Nếu chế độ thổi khí ở mức thấp thì bào tử phát triển yếu, mật độ thưa, nếu chế độ thổi khí ở mức cao bào tử phát triển nhanh thời gian lên men ngắn, tinh thể độc tố nhỏ, hiệu quả diệt sâu không cao, nên chế độ thổi khí như trên là hợp lý nhất.
- Thu nhận sản phẩm: Sau khi lên men được 48 – 72 giờ ta tiến hành tách sản phẩm bằng cách lọc và ly tâm lạnh 4000 vòng/phút, thu kết tủa. Sau đó bổ sung thêm một số chất định hình và bảo quản rồi đem đi sấy khô trong điều kiện thường hoặc
chân không ở nhiệt độ 50 – 65o
C trong 1h, 70 – 80oC trong vòng 20 phút, độ ẩm giảm xuống từ 3 – 5% thì đạt.
- Hoàn thiện sản phẩm, sản phẩm sẽ được đóng gói, chế thành các dạng chế phẩm khác nhau. Hiệu quả phòng trừ bằng chế phẩm Bt không hoàn toàn quyết định bởi thành phần hoạt tính của chế phẩm mà dạng chế phẩm cũng là một nhân tố quan trọng.
- Các dạng chế phẩm Bt
+ Thuốc Bt dạng lỏng: Sau khi kết thúc quá trình lên men thu hồi sinh khối, phối trộn với các chất phụ gia, chất bám dính, chất chống thối để tạo ra chế phẩm Bt. Kiểm tra chất lượng, cuối cùng đóng chai để bảo quản.
+ Thuốc Bt dạng sữa: Thu sinh khối, sử dụng phương pháp ly tâm thu nhận bào tử và tinh thể độc, sau đó tiến hành nhũ tương hóa. Chế phẩm thu được ở dạng nhão nhớt.
+ Thuốc Bt dạng bột: phổ biến và tiện lợi, dễ sử dụng, dễ bảo quản. Thu nhận bào tử và tinh thể độc bằng ly tâm, sau đó được làm khô bằng phương pháp đông lạnh hoặc sấy khô trong máy sấy phun. Để tăng độ bám dính của thuốc trộn với các chất phụ gia như bột mỳ, dextrin,…cuối cùng kiểm tra chất lượng, đóng gói và bảo quản để sử dụng. Hình 6.14. Quy trình sản xuất chế phẩm Bt Giống gốc Sản xuất giống cấp 1 Sản xuất giống cấp 2
Chuẩn bị môi trường
Khử trùng Thổi khí Lên men 48 – 72 giờ,