2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp phân tích, xác định đặc điểm sinh hĩa và khả năng tiêu
VÀ KHẢ NĂNG TIÊU HĨA CỦA CÁ MÚ CHẤM CAM
2.2.2.1. Xác định thành phần khối lượng của cá.
Thu mẫu với số lượng 12 cá thể cá mú chấm cam thương phẩm ở các kích cỡ khác nhau. Tiến hành phi lê, tách nội tạng, đầu, xương để cân và xác định thành phần khối lượng.
2.2.2.2. Xác định enzyme tiêu hĩa Chuẩn bị dịch chiết enzyme [29, 43] Chuẩn bị dịch chiết enzyme [29, 43]
Chuẩn bị mẫu: Cá mú giống chấm cam được thu mẫu với số lượng 18 con, cá sau
khi cho nhịn ăn 12 giờ được đưa vào tủ đơng ở nhiệt độ -200C để gây chết và kiềm hãm sự thất thốt enzyme trong thời gian 20 phút. Mổ tách các cơ quan tiêu hĩa (dạ dày, manh tràng, ruột). Làm sạch từng cơ quan, rửa lại bằng nước cất và cho vào các ống 150 ml để bảo quản, cân và ký hiệu mẫu cho mỗi cá thể.
Tiến hành thu dịch chiết enzyme của từng cơ quan tiêu hĩa như ruột, manh tràng và dạ dày của cá bằng cách xay nhuyễn ruột, manh tràng và cạo lớp màng nhầy bên trong dạ dày. Các mẫu dịch thu được sau đĩ đem đi pha lỗng với nước cất lạnh (40C) theo tỉ lệ 1:3 (W/V) và đưa đi nghiền với bột thủy tinh theo tỉ lệ 3:1 (W/W). Dung dịch sau khi nghiền được đem đi lọc, li tâm ở 40C, tốc độ 10.000 v/ph trong 20 phút. Kết thúc li tâm, cho dịch chiết enzyme vào các ống eppendoffs và đem đi bảo quản ở -300C.
2.2.2.3. Điện di SDS-PAGE phát hiện hoạt tính enzyme [68].
Nguyên lý: Cho dịch chiết enzyme vào bản gel. Dưới tác dụng của dịng điện, các
phân tử protein tích điện sẽ bị chuyển dịch và phân tích thành nhiều băng trên bản gel. Vị trí và độ rộng của các băng cho biết kích thước protein. Sử dụng cơ chất đặc hiệu phản ứng với các enzyme trên bản gel để nhận biết loại enzyme cĩ mặt trong các băng protein [phụ lục 1, mục 1.3].
2.2.2.4. Xác định hoạt độ pepsin [48]
Nguyên lý: Dịch chiết enzyme thủy phân dung dịch protein 0,5% trong 1 h ở
370C. Dùng thuốc thử albumin xác định độ thủy phân thơng qua việc đo mật độ quang. Lượng protein bị thủy phân biểu thị hoạt độ pepsin [phụ lục 1, mục 1.4].
2.2.2.5. Xác định hoạt độ amylase [113]
Nguyên lý: α - amylase xúc tác thủy phân cơ chất CNP-G3 (2-chloro - 4-
nitrophenyl-alphamaltotriosite) và giải phĩng CNP (2-chloro-4-nitrophenol) làm tăng tốc độ hấp thu ánh sáng ở bước sĩng 405nm [phụ lục 1, mục 1.5].
2.2.2.6. Xác định hoạt độ chymotrypsin [107]
Nguyên lý: Dưới tác dụng của chymotrypsin cĩ trong dịch chiết enzyme sẽ thủy phân cơ chất (N-acetyl- L- tyrosine ethyl ester). Lượng tyrosin giải phĩng được xác định bằng cách đo mật độ quang ở bước sĩng 237 nm [phụ lục 1, mục 1.6].
2.2.2.7. Xác định hoạt độ trypsin [107]
Nguyên lý: Trypsin cĩ trong dịch chiết enzyme sẽ thủy phân cơ chất (N-benzoyl-
l-arginine ethyl ester hydrocholoride). Lượng arginine giải phĩng được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sĩng 253 nm [phụ lục 1, mục 1.7].
2.2.2.8. Xác định tỉ lệ acid amin thiết yếu trong thức ăn [106, 112]
Nhu cầu a.a thiết yếu cần thiết phải cĩ trong thức ăn được tính tốn trên cơ sở thành phần EAAs (carcass EAAs pattern) cĩ trong tồn bộ cơ thịt cá. Nhu cầu các a.a thiết yếu (bao gồm cả các a.a thay thế methionine và phenylalanine khơng thiết yếu như tyrosine và cystine) chiếm tỉ lệ khoảng 35% trong tổng nhu cầu protein khẩu phần của cá. Từ kết quả phân tích thành phần các acid amin trong tồn bộ cơ thịt cá, xác định thành phần tỉ lệ các EAAs và tyrosine, cystine. Tùy thuộc vào nhu cầu protein khẩu phần của đối tượng thủy sản, nhu cầu các a.a (EAAs) thiết yếu (%) trong thức ăn được xác định theo cơng thức (2.1) [106, 112].
(%) 10000 35 i i k p a × × = (2.1) Trong đĩ:
ai (%): Tỉ lệ a.a thiết yếu thứ i trong thức ăn. p: Hàm lượng protein trong thức ăn
ki: Thành phần EAAs (bao gồm cả tyrosine và cystine) thứ i trong tồn bộ cơ thịt cá. ∑ = = 12 1 100 i i k (%). (2.2)
2.2.2.9. Phương pháp đánh giá khả năng tiêu hĩa in vivo
Khả năng tiêu hĩa protein và chất khơ biểu kiến của cá mú chấm cam đối với các nguyên liệu làm thức ăn đã được nghiên cứu khá phổ biến và đã cĩ nhiều các dữ liệu, thơng tin về khía cạnh này [88]. Vì vậy, đề tài tập trung nghiên cứu đánh giá nhanh khả năng tiêu hĩa protein và chất khơ biểu kiến của cá mú chấm cam đối thức ăn cơng nghiệp dạng viên, gĩp phần làm cơ sở cho việc lựa chọn nguyên liệu trong xây dựng cơng thức thức ăn cho cá.
Để đánh giá khả năng tiêu hĩa in vivo của cá đối với thức ăn được tạo thành từ các loại nguyên liệu khác nhau, tiến hành sử dụng 05 nghiệm thức (NT) thức ăn. Do tập tính của cá là ăn thức ăn tươi sống, vì vậy để đánh giá khả năng thay thế hồn tồn cá tạp làm thức ăn cho cá, NT1 được bố trí sử dụng 30% cá cơm tươi trong khẩu phần, NT2 được thay hồn tồn cá cơm tươi bằng bột cá, các nghiệm thức 3, 4, 5 được bổ sung dầu gan mực, bã nành, dịch thủy phân cá tạp và khơng sử dụng bột đậu nành nguyên hạt. Sau thời gian khoảng 05 ngày, khi cá thích nghi tốt với hệ thống ni tuần hồn và chủ động ăn thức ăn chế biến, các thí nghiệm xác định khả năng tiêu hĩa biểu kiến được tiến hành. Các bể thí
nghiệm được thiết kế hệ thống tuần hồn nước cĩ lọc san hơ. Mỗi bể đều cĩ bơm đẩy và ống thu phân, thực hiện thí nghiệm trong thời gian 10 ngày.
Các nghiệm thức thức ăn được dùng để đánh giá mức độ tiêu hĩa protein biểu kiến của cá mú được thể hiện trên bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần nguyên liệu của 05 NT thí nghiệm
Chất bổ sung gồm: chất kết dính (1%), premix vitamin (1,5%), protein concentrate (3,5%)
Lượng Cr2O3 được xem như khơng bị hấp thu và mất trong quá trình tạo viên.
Thành phần cá cơm tươi: chất khơ (22,7%); ẩm (77,3%).
Tạo viên thức ăn bằng máy ép đùn một trục vít với kích thước viên (đường kính x chiều cao viên): Ø x h = 5x 5(mm) và sấy khơ ở nhiệt độ 70oC.
Bố trí thí nghiệm
Do khơng cĩ sự khác biệt về việc sử dụng chất đánh dấu trong nghiên cứu tiêu hĩa in vivo [41]. Vì vậy, để tiện theo dõi trong quá trình thử nghiệm, sử dụng chất đánh dấu trong nghiệm thức 1 và 2 là Cr2O3 và phần xơ thơ sẵn cĩ trong khẩu phần của các nghiệm thức 3â, 4, 5 được xem như là chất đánh dấu. Mỗi NT được bố trí 03 bể thí nghiệm (100 l/bể) và hồn tồn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại. Mật độ cá nuơi ở các bể nuơi là 5 con/bể, cỡ cá trung bình 80 g/con. Bổ sung dịch đạm thủy phân như là chất hấp dẫn làm tăng khả năng bắt mồi vào các NT3, 4 với tỉ lệ 1% (NT3), 5% (NT4) và đối chứng 0% (NT5). Lượng thức ăn hàng
STT Thành phần NT1 (%) NT2 (%) NT3 (%) NT4 (%) NT5 (%) 1 Cá cơm tươi 30 - - - -
2 Bột cá Kiên Giang (55% protein ) 30 60 38 - -
3 Bột cá Cà Mau (63% protein) - - - 28 31
4 Bột gan mực (48% protein) - - 10 10 10
5 Dịch đạm thủy phân (16% protein) - - 1 5 0
6 Bột đậu nành nguyên hạt (34% protein) 20 20 - - -
7 Bã nành Argentina (44,5% protein) 13 13 28 38 15
8 Bột mì Bình Đơng (12% protein) - - 20 16 16
9 Cr2O3 1 1 - - -
ngày từ 1,5 - 2% khối lượng thân cá, cho ăn 2 lần trong ngày (sáng: 8 giờ và chiều: 14 giờ). Phân cá được thu ngay khi phát hiện cá thải, thường là sau khi cá ăn khoảng 4 giờ. Sau đĩ phân được đem đi trữ lạnh ở 0oC, ly tâm (6000 v/p) trong 5 phút, sấy khơ ở nhiệt độ 40oC, bảo quản và đem đi phân tích sinh hĩa.
Xác định khả năng tiêu hĩa biểu kiến
Phân tích Cr2O3 theo phương pháp kỹ thuật phá mẫu bằng acid mạnh
(Wanatabe, 2001).
Khả năng tiêu hố protein biểu kiến được xác định theo cơng thức
(Spyridakis & cộng sự, 1989) (%) 100 100 ( ) D C B A ACPD = − × × (2.3) Trong đĩ:
ACPD: Khả năng tiêu hĩa protein biểu kiến. A: % chất đánh dấu trong khẩu phần.
B: % chất đánh dấu trong phân. C: % dưỡng chất trong phân. D: % dưỡng chất trong khẩu phần.
Khả năng tiêu hố chất khơ biểu kiến được xác định theo cơng thức
(Maynard & Loosli, 1956)
⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎝ ⎛ × − = N M ADMD (%) 100 100 (2.4) Trong đĩ:
ADMD: Tiêu hĩa chất khơ biểu kiến. M: Xơ thơ trong khẩu phần,
2.2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH LÝ, HĨA CỦA NGUYÊN LIỆU HĨA CỦA NGUYÊN LIỆU
Xác định độ ẩm theo TCVN 4326:1986.
Xác định protein thơ bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 4328:2001. Xác định NFE (%) =100% –[ẩm% + protein% + lipid% + tro% + xơ thơ%]. Xác định lipit thơ bằng phương pháp trích ly theo TCVN 4331:2001.
Xác định hàm lượng tro theo TCVN 4327:1986. Xác định hàm lượng xơ thơ theo TCVN 4329:1993.
Xác định a.a. bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
Xác định acid béo bằng phương pháp sắc ký khí GC-ISO/CD 5509:1994. Xác định các chỉ tiêu màu sắc, mùi, vị, trạng thái theo TCVN 3215 – 79.
2.2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT THỨC ĂN NUƠI CÁ MÚ CHẤM CAM NUƠI CÁ MÚ CHẤM CAM
2.2.4.1. Phương pháp đo và xác định các thơng số cơng nghệ
Xác định độ ẩm bằng thiết bị đo độ ẩm PM-400, Tokyo, Japan.
Xác định tốc độ quay của trục vít của phễu cấp liệu và tạo viên bằng máy đo tốc độ Tachometer, DT-2236, Japan.
Xác định khối lượng thức ăn bằng cân 02 số lẻ, Satorius GM 1012. Xác định chiều cao viên bằng thước kẹp TRICLABRAND - Shanghai. Kích thước viên được điều chỉnh bằng tốc độ dao cắt.
Xác định nhiệt độ của sản phẩm sau khi tạo viên bằng nhiệt kế cĩ đầu dị, HANNA, HI 151-00 (Checktemp 4c)ø.
Xác định nhiệt độ vùng ép:
Bao xung quanh ống dẫn ở vị trí vùng ép bằng các điện trở gia nhiệt. Vùng biến thiên nhiệt độ của thiết bị đo trong phạm vi từ 0 đến 3990C. Biên độ lệch của điểm cài đặt nhiệt độ là ± 10C. Khoan 01 lỗ tại vùng ép ở độ sâu 1cm để
gắn đầu dị nhiệt độ với thiết bị đo. Khi nhiệt độ vùng ép nhỏ hoặc lớn hơn giá trị cài đặt, thì bộ điều khiển sẽ nối hoặc ngắt dịng điện với các điện trở để tăng hoặc giảm nhiệt độ.
Xác định độ mặn bằng thiết bị đo Salinity Refractometer S/Mill – E, Cat. No.2442, khoảng đo từ 0 -100‰.
Chuẩn bị mẫu thức ăn để đo dung trọng và độ bền trong nước:
Thức ăn sau khi tạo viên được đem đi sấy ở nhiệt độ 800C trong thời gian từ 20 - 35 phút, tiếp tục đem đi làm nguội để đạt độ ẩm khoảng 9% và tiến hành đo dung trọng và độ bền trong nước.
Mơ hình hĩa q trình ép đùn tạo viên thức ăn:
Trên cơ sở phân tích hệ thống ép đùn tạo viên thức ăn cá mú chấm cam cho thấy các yếu tố như độ ẩm vật liệu, nhiệt độ vùng ép và chiều cao viên ảnh hưởng đến các đặc tính vật lý (dung trọng, độ bền trong nước) của viên thức ăn. Ngồi ra, tốc độ cấp liệu cũng là một yếu tố rất quan trọng, một cách gián tiếp tốc độ cấp liệu tác động đến tốc độ dịng vật liệu do trục vít vận chuyển bên trong ống dẫn, do vậy rõ ràng rằng tốc độ cấp liệu tác động và ảnh hưởng mạnh đến đặc tính vật lý của viên thức ăn.
Xác định dung trọng (Harper, 1979):
Dung trọng thức ăn là khối lượng của một đơn vị thể tích thức ăn bao
gồm cả khơng gian giữa các hạt. Được xác định bằng cách rĩt nhẹ thức ăn vào ống đong 1000 ml cho đến khi đạt đến vạch mức 1000 ml, dùng muỗng để điều chỉnh thể tích. Cân và xác định khối lượng thức ăn trên một đơn vị thể tích. Lặp lại thí nghiệm 3 lần và lấy kết qủa trung bình.
Xác định tốc độ chìm của viên thức ăn (Vassallo & Doglioli, 2005):
Thiết bị thí nghiệm gồm một ống thủy tinh cĩ đường kính 7 cm, cao 43 cm được dùng để đo tốc độ chìm của viên thức ăn và đồng hồ bấm giây điện tử hiệu
Casio. Tốc độ chìm của viên thức ăn được tính bằng tỷ số giữa quãng đường di chuyển và thời gian để viên thức ăn di chuyển hết qng đường đĩ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần cho mỗi mẫu thức ăn .
Xác định độ bền trong nước (WS) của viên thức ăn:
Độ bền trong nước được tính bằng số phút quan sát kể từ khi thả thức ăn vào cốc thủy tinh chứa nước cho đến khi hầu hết các viên thức ăn vẫn cịn giữ nguyên hình dạng và được xác định tương tự như phương pháp xác định độ bền trong nước của viên thức ăn nuơi tơm, cá [24]. Lấy khoảng 5 g thức ăn cho vào cốc thủy tinh 250 ml chứa 200 ml nước. Cứ khoảng 15 phút dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ một vịng và quan sát. Nếu hầu hết các viên thức ăn cịn giữ nguyên hình dạng, cĩ thể cầm được mà khơng bị vỡ là thức ăn chưa bị tan rã.
2.2.4.2. Phương pháp thống kê thực nghiệm
Miền lân cận điểm cực trị là miền phi tuyến, ngày nay phương pháp phổ biến nhất để mơ tả miền gần cực trị là dùng đa thức bậc hai, do những phương án bậc hai được nghiên cứu đầy đủ, các bề mặt bậc hai dễ dàng được hệ thống hĩa và do đĩ dễ dàng xác định được điểm cực trị, mặt khác sự tăng bậc của đa thức sẽ dẫn đến việc tăng số thí nghiệm lên nhiều lần. Ngồi ra, sự lựa chọn phương án nghiên cứu này hay phương án khác cịn được quyết định bởi nhiệm vụ đặt ra và khả năng thực nghiệm [1]. Do đĩ, mơ hình hĩa q trình tạo viên được thực hiện theo phương pháp thống kê thực nghiệm và mơ hình dự đốn sẽ là mơ hình bậc hai. Trên cơ sở phân tích các phương án qui hoạch, mơ hình tốn học q trình ép đùn thức ăn được thực hiện theo phương án qui hoạch thực nghiệm tối ưu hĩa D [4, 14, 21, 65, 78, 87, 89], [Phụ lục 3, mục 3.1, 3.2].
2.2.4.3. Tối ưu hĩa đa mục tiêu bằng phương pháp vùng cấm [6, 117, 118]
Tối ưu hĩa bằng phương pháp vùng cấm được sử dụng trong việc xây dựng CTTA nuơi cá mú chấm cam và nghiên cứu tối ưu hĩa chế độ cơng nghệ ép đùn.
Trong thực tế nhiều BTTƯ đa mục tiêu được đặt ra cĩ các điều kiện ràng buộc đối với chính giá trị của các hàm mục tiêu thành phần Ij(Z). Giả sử rằng bài tốn
tối ưu hĩa đa mục tiêu với các hàm mục tiêu thành phần là bài tốn cực tiểu, thì điều kiện ràng buộc cĩ dạng:
Ij(Z) < Cj , j = 1÷m (2.5) Các ràng buộc (2.5) tạo thành vùng cấm C = { Ij(Z) > Cj } đối với hàm mục tiêu
I(Z). Phương pháp vùng cấm đề xuất cách giải BTTƯ đa mục tiêu với chuẩn tối
ưu tổ hợp R(Z) : R(Z) = r1(Z).r2(Z)...rm(Z) = ( ) 1 Z rj m j ∏ = (2.6) Trong đĩ:
rj(Z) = [ Cj – Ij(Z)] / [Cj – Ijmin ] khi Ij(Z) < Cj (2.7) và : rj(Z) = 0 khi Ij(Z) > Cj (2.8) Với chuẩn tối ưu tổ hợp R(Z), BTTƯ m mục tiêu được xác định là hãy tìm nghiệm
ZR= (Z1R, Z2R , … , ZnR) nằm trong miền giới hạn ΩZ sao cho hàm mục tiêu R(Z) đạt giá trị cực đại.
Rmax = R(ZR) = max R(Z) = max [ ( )
1 Z rj m j ∏ = ] (2.9) Z = { Zi } = (Z1, Z2 , … , Zn ) Є ΩZ Dễ dàng thấy rằng 1 ≥ R(ZR) ≥ 0, Trong đĩ:
R(ZR) = 1 khi nghiệm tối ưu chính là nghiệm khơng tưởng ZUT và R(ZR) = 0 khi chỉ cần một trong các giá trị Ij(Z) vi phạm bất đẳng thức (2.5), nghĩa là khi điểm
I(Z) rơi vào vùng cấm C. Nghiệm tối ưu ZR đã được chứng minh là một nghiệm paréto-tối ưu. Ký hiệu I(ZR) = IP,R = (I1P,R, I2P,R , … , ImP,R). Với nghiệm tối ưu ZR,
hiệu quả paréto-tối ưu. IP,R = (I1P,R, I2P,R , … , ImP,R) đứng cách xa vùng cấm C nhất.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NUƠI ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ THỨC ĂN
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
Cá mú chấm cam giống cỡ 8 -12 g/con, nguồn gốc tại Trung Tâm QGGHSNB. Nghiệm thức (NT) thử nghiệm là thức ăn nghiên cứu ký hiệu là FON và NT đối chứng là thức ăn thương mại ký hiệu là UP. Hệ thống nuơi được bố trí với 08 bể, loại composite, thể tích 0,5 m3/bể. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên gồm 02 nghiệm thức (NT) thức ăn với 04 lần lặp lại. Sơ đồ hệ thống các bể nuơi được mơ tả ở hình 2.4
Hình 2.4. Sơ đồ hệ thống nuơi in vivo
Cá mú chấm cam giống được thả với mật độ là 25 con/bể. Nước nuơi tại các bể cĩ độ mặn từ 20-30 ppt. Thí nghiệm được thực hiện trong 60 ngày, bắt đầu