Dựa vào phản ứng kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, có thể phát hiện bất kỳ protein nào của tế bào và mô, miễn sao có kháng thể tương ứng. Vị trí kết hợp được hiển thị dưới kính hiển vi quang học theo 2 cách: nhờ hoạt động của 1 enzym làm hiện mầu, tương ứng với kỹ thuật hoá mô miễn dịch men; hoặc 1 phẩm nhuộm huỳnh quang, tương ứng với kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.
a. Hoá mô miễn dịch men (immunohistochemistry)
Kháng thể được gắn với enzyme, thường là peroxydase. Khi cho thêm chất hiện màu như diaminobenzidine (DAB) cùng với H2O2 vào mẫu mô, peroxidase sẽ oxy hoá diaminobenzidine thành 1 chất mầu nâu, kết tủa ngay tại vị trí có phức hợp kháng nguyên-kháng thể, thấy được dưới kính hiển vi quang học. Có thể phân biệt 2 loại hóa mô miễn dịch men:
- Hóa mô miễn dịch men trực tiếp: peroxidase được gắn trực tiếp vào kháng thể thứ nhất đặc hiệu với kháng nguyên.
- Hóa mô miễn dịch men gián tiếp: nhằm khuếch đại chất kết tủa mầu nâu để dễ quan sát, peroxidase không được gắn vào kháng thể thứ nhất, nhưng vào kháng thể thứ hai (đặc hiệu với kháng thể thứ nhất) qua trung gian phức hợp Avidin-Biotin; mỗi phức hợp này cho phép gắn cùng lúc nhiều phân tử peroxidase. (Hình 12)
Hình 12: Kỹ thuật hoá mô miễn dịch men trực tiếp và gián tiếp.
Hiện nay, tiến bộ về công nghệ sinh học khiến dach sách các kháng thể ngày một dài thêm; thúc đẩy sự ứng dụng rộng rãi kỹ thuật hoá mô miễn dịch men trong chẩn đoán các bệnh lý u bướu. Trước hết, hoá mô miễn dịch có thể phân biệt nguồn gốc xuất phát của các u biệt hoá kém là từ biểu mô, trung mô hoặc mô tạo huyết; trong một số trường hợp, hoá mô miễn dịch giúp đánh giá tiên lượng và đáp ứng điều trị (thí dụ đánh giá tình trạng thụ thể nội tiết estrogen, progesteron, thụ thể Her-2/neu trong carcinôm ống tuyến vú); gần đây, có những kháng thể giúp phân biệt giữa 1 u lành và 1 u ác tính biệt hoá cao (thí dụ sarcôm mỡ biệt hoá cao có hình ảnh vi thể giống hệt u mỡ lành, sẽ có MDM2 dương tính). (Hình 13, 14 và 15)
Hình 13: Nhuộm hoá mô miễn dịch men để phân biệt nguồn gốc xuất phát: Một u vòm hầu tạo bởi các tế bào ác tính biệt hoá kém không rõ nguồn gốc từ biểu mô hay mô tạo huyết (A), kết quả dương tính với kháng thể chống cytokeratin (B); âm tính với kháng thể chống kháng nguyên chung của bạch cầu (LCA: leukocyte common antigen) (C); chứng tỏ đây là 1 u ác tính xuất phát từ biểu mô (carcinôm).
Hình 14: Hoá mô miễn dịch men đánh giá tiên lượng và dự đoán đáp ứng điều trị: 1 trường hợp carcinôm ống tuyến vú xâm nhiễm (A); có thụ thể với estrogen và progesteron trong nhân dương tính (B và C); sẽ có tiên lượng tốt hơn trường hợp thụ thể âm tính và có khả năng đáp ứng với điều trị nội tiết.
20
Hình 15: Hoá mô miễn dịch men phân biệt lành ác: 1 trường hợp sarcôm mỡ có hình ảnh vi thể giống hệt u mỡ lành tính (A); nhân tế bào dương tính với MDM2 chứng tỏ đây là sarcôm mỡ biệt hoá cao (B).
Ngoài ra, kỹ thuật hóa mô miễn dịch men còn có ưu điểm là có thể thực hiện trên các lát cắt từ mẫu bệnh phẩm đã được cố định bằng formol và vùi paraffin; chất kết tủa mầu nâu bảo tồn được trong nhiều năm, thuận tiện cho việc xem lại tiêu bản khi cần thiết.
b. Miễn dịch huỳnh quang(immunofluorescence)
Kháng thể được gắn với phẩm nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) là chất có khả năng phát tia huỳnh quang sau khi được kích thích bằng ánh sáng đơn sắc có bước sóng thích hợp; thí dụ fluorescein phát tia huỳnh quang mầu xanh lá cây khi được kích thích bởi ánh sáng có bước sóng 494nm, rhodamin phát tia huỳnh quang mầu đỏ với ánh sáng 550nm. Như vậy, khi có phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể (nghĩa là có sự hiện diện của kháng nguyên cần tìm trong mẫu mô), phức hợp này sẽ phát huỳnh quang khi được kích thích bởi ánh sáng đơn sắc, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Chất phát huỳnh quang có thể được gắn trực tiếp vào kháng thể đặc hiệu, gọi là phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp; hoặc gắn vào kháng thể thứ hai đặc hiệu với kháng thể thứ nhất, gọi là miễn dịch huỳnh quang gián tiếp. Miễn dịch huỳnh quang được sử dụng chủ yếu trong chẩn đoán các bệnh lý cầu thận và một số bệnh lý của da. Nhược điểm của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang là thường phải thực hiện trên lát cắt từ mô tươi (cắt lạnh); khả năng phát tia huỳnh quang chỉ kéo dài khoảng 1 tuần và cần có kính hiển vi huỳnh quang để quan sát. (Hình 16)
Hình 16: Bệnh thận IgA: có sự lắng đọng chất đậm đặc ở vùng gian mao mạch PAS dương tính (A); nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể chống IgA gắn fluorescein, chất đậm đặc phát tia huỳnh quang xanh (B), chứng tỏ đây là IgA.
MỘT SỐ CÂU HỎI TỰ LƯỢNG GIÁ
1. Cố định bệnh phẩm:
A/ Nhằm giữ nguyên hình thái tế bào và mô giống như lúc còn trong cơ thể. B/ Để bảo tồn cấu trúc phân tử của tế bào và mô.
C/ Formol trung tính 40% là loại dung dịch cố định được dùng nhiều nhất. D/ Tất cả A, B, C đúng.
E/ Chỉ A và B đúng.
2. Xử lý mô:
A/ Gồm 3 bước là khử nước, làm trong và thấm paraffin. B/ Nếu mẫu mô có chứa xương, cần thêm bước khử canxi.
C/ Nhằm thấm paraffin vào trong mẫu mô để nó đủ cứng cho khâu cắt mỏng. D/ Tất cả A, B, C đúng.
E/ Chỉ A và C đúng.
3. Độ dầy trung binh của lát cắt mỏng:
A/ 0,5µm. B/ 5µm. C/ 50µm. D/ 0,5mm. E/ 5mm.
4. Về cắt lạnh, phát biểu sau KHÔNG ĐÚNG:
A/ Thường được sử dụng để có chẩn đoán giải phẫu bệnh trong vòng 10-30 phút. B/ Mẫu mô phải được cố định bằng formol 10% trước khi cắt.
C/ Mẫu mô được làm cứng lại ở nhiệt độ âm 20oC nhờ dung dịch OCT.
D/ Dung dịch OCT ức chế sự hình thành các tinh thể nước đá có thể làm vỡ tế bào. E/ Máy cắt lạnh giúp thực hiện những lát cắt dày 5µm.
5. Phát biểu sau KHÔNG ĐÚNG về khâu nhuộm:
A/ Giúp thấy được các thành phần cấu tạo của tế bào và mô. B/ Phẩm nhuộm có nguồn gốc tự nhiên hoặc nhân tạo. C/ Hầu hết phẩm nhuộm đều tan trong xylen.
D/ Phương pháp nhuộm Hematoxylin-Eosin được sử dụng rộng rãi nhất.
E/ Nhuộm đặc biệt giúp thấy rõ 1 thành phần cấu tạo riêng biệt của tế bào và mô.
6. Về kỹ thuật hoá mô miễn dịch, phát biểu sau KHÔNG ĐÚNG :
A/ Dựa trên phản ứng kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
B/ Giúp phát hiện các loại protein của tế bào và mô nhờ vào kháng thể đặc hiệu tương ứng. C/ Hiển thị kết hợp kháng nguyên-kháng thể bằng enzym hoặc phẩm nhuộm huỳnh quang. D/ Thay thế hầu hết các phương pháp nhuộm đặc biệt.
22
TỔN THƯƠNG CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO VÀ MÔ
Mục tiêu:
1. Mô tả và phân tích 5 loại đáp ứng thích nghi. 2. Mô tả và phân tích 4 loại ứ đọng nội bào. 3. Mô tả và phân tích 4 loại lắng đọng ngoại bào.
4. Mô tả các đặc điểm hình thái của hoại tử tế bào và tự hủy tế bào. 5. Mô tả và phân tích các hình thái mô học của hoại tử.
Giải phẫu bệnh đại cương nghiên cứu về các tổn thương cơ bản, là tổn thương chung của mọi loại bệnh lý ở các cơ quan và hệ thống khác nhau.
Tổn thương cơ bản là các biến đổi hình thái của tế bào và mô gây ra bởi các nguyên nhân bệnh lý hoặc sinh lý, gồm có 7 loại là: các đáp ứng thích nghi, ứ đọng nội bào, lắng đọng ngoại bào, hoại tử, viêm, u, tổn thương huyết quản huyết do rối loạn tuần hoàn.
CÁC ĐÁP ỨNG THÍCH NGHI
Là các biến đổi hình thái của tế bào và mô nhằm thích ứng với môi trường xung quanh đã bị thay đổi. Có 5 loại đáp ứng thích nghi sau: