Kỹ thuật tái tổ hợp ADN cho phép chuyển một gen điều khiển sinh tổng hợp một enzym có ích nμo đó từ cơ thể nμy sang một cơ thể khác. Cơ thể nhận gen ngoại lai gọi lμ vật chủ. Mục đích của quá trình chuyển gen nμy lμ để tạo ra một vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym có ích mμ việc nuôi vi sinh vật nμy trong điều kiện đơn giản hơn, quá trình chiết xuất vμ tinh chế enzym dễ dμng hơn. Nh− vậy sẽ hiệu quả kinh tế hơn. Nguyên tắc chuyển gen để tạo enzym đ−ợc minh hoạ ở sơ đồ hình 4.1.
Bằng kỹ thuật chuyển gen nêu trên, hãng Novo Nordisk đã thực hiện chuyển đoạn ADN gen từ nấm mốc Humicola languinosa sang cho Aspergillus oryzae tạo đ−ợc enzym lipolase sản xuất thích hợp trên qui mô công nghiệp dùng trong nghiên cứu enzym. Công nghiệp tẩy rửa đạt hiệu quả kinh tế cao. Lipolase bền vững ở nhiệt độ vμ các pH khác nhau. Sự biến đổi các enzym nhằm cải thiện đặc điểm xúc tác của chúng chỉ mới thực hiện trong vμi thập kỷ vừa qua. Tr−ớc đây, công việc đó xảy ra một cách ngẫu nhiên, còn hiện nay mọi sự thay đổi đều có thể thiết kế mô hình vμ thực hiện nó một cách chủ động vμ có hiệu quả. Bảng 4.4 cho ta thấy các mục tiêu chính để nghiên cứu enzym.
Sự phát triển của VSV với enzym đ−ợc sử dụng Tinh chế mARN tổng hợp mARN Tinh chế enzym Phân tích một phần chuỗi amino acid
Tổng hợp các mẫu oligonucleotid
Xác định cADN sợi đơn bằng cách lai với mẫu oligo
Tái tổ hợp AND vào E.coli(c.ADN)
Chuyển vào vật chủ SX công nghiệp (Aspergillus oryzae)
Sản xuất công nghiệp enzym
Bảng 4.4. Những vấn đề cần nghiên cứu để biến đổi enzym
• Nâng cao hoạt tính của enzym. • Tăng độ ổn định.
• Cho phép enzym hoạt động ở môi tr−ờng thay đổi. • Thay đổi pH hoặc nhiệt độ tối −u.
• Thay đổi hẳn đặc tính của enzym nh− chúng có thể xúc tác cho sự biến đổi một cơ chất hoàn toàn khác.
• Thay đổi phản ứng xúc tác. • Nâng cao hiệu quả của quá trình.
Kỹ thuật protein còn đ−ợc gọi lμ “phẫu thuật phân tử” đã đ−ợc sử dụng để thực hiện biến đổi các phân tử enzym. Kỹ thuật protein của enzym có liên quan đến mô hình không gian ba chiều của một enzym tinh khiết khi tiến hμnh nhiễu xạ phân tử bằng tia X. Sự thay đổi cấu trúc của enzym cũng có thể lμ kết quả lμm tăng tính ổn định của enzym. Ví dụ, pH vμ nhiệt độ, yêu cầu biến đổi phân tử enzym đ−ợc thực hiện bằng chính sự thay đổi mã di truyền của vi sinh vật tạo ra enzym. Có hai con đ−ờng chính để nghiên cứu thực hiện mục tiêu đó. Thứ nhất lμ đột biến gen để vi sinh vật tạo ra enzym có cấu trúc mμ thμnh phần vμ trình tự các amino acid thay đổi. Ph−ơng pháp thứ hai có liên quan đến chiết xuất enzym tự nhiên vμ lμm biến đổi cấu trúc phân tử của chính enzym đó bằng hoá học - đôi khi còn gọi lμ đột biến “hoá học”. Một ví dụ để minh hoạ cho điều đó lμ: đã lμm biến đổi cấu trúc của enzym phospholipase A2 bền vững hơn trong môi tr−ờng acid vμ enzym nμy đ−ợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa. Rõ rμng lμ kỹ thuật gen vμ vμ kỹ thuật protein đã đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu enzym dùng trong công nghiệp. Kỹ thuật gen góp phần lμm giảm giá thμnh sản phẩm, tạo ra các enzym mới từ vi sinh vật, các ch−ơng trình nghiên cứu sẽ phát triển nhanh hơn ...
4. Kỹ thuật sản xuất enzym
Mặc dù có nhiều enzym đ−ợc sử dụng có nguồn gốc từ thực vật vμ động vật, song nguồn enzym đó không thể thoả mãn nhu cầu của cuộc sống, vì vậy phải tìm nguồn enzym phong phú từ vi sinh vật. Ngay cả quá trình đ−ờng hoá tinh bột tr−ớc đây sử dụng malt (thóc mầm), thì ngμy nay cũng đã đ−ợc thay thế bằng amylase từ vi sinh vật hiệu quả hơn.
Sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzym có mấy lợi thế sau:
− Hoạt tính cao trên một đơn vị sản phẩm tính theo trọng l−ợng khô. − Không phụ thuộc vμo thời tiết, thời vụ do quá trình thực hiện trong
− Các enzym vi sinh vật có đặc điểm lμ hoạt độ mạnh trong phạm vi rộng của pH vμ nhiệt độ, đồng thời cũng có tính chọn lọc cao (asparaginase).
− Di truyền công nghiệp cho phép lựa chọn vμ tạo ra những vi sinh vật cho hiệu suất enzym cao, dễ dμng lên men vμ chiết xuất, tinh chế... Các enzym đặc biệt khó sản xuất th−ờng đ−ợc chuyển gen vμo những vật chủ nh− Aspergillus oryzae vì đã biết rõ đặc điểm phát triển của chúng nên không cần phải nghiên cứu tốn kém.
Để chọn những vi sinh vật sản xuất enzym cần chú ý các tiêu chuẩn sau đây: vi sinh vật đó đòi hỏi điều kiện lên men đơn giản, enzym ngoại bμo, qui trình thu sản phẩm vμ tinh chế không phức tạp, enzym ổn định trong khoảng nhiệt độ vμ pH rộng. Tuỳ theo mục đích sử dụng mμ chọn các enzym cho phù hợp. Ví dụ, các enzym dùng trong y học cần hoạt tính enzym cao ở pH trung tính. Các enzym dùng trong công nghiệp tẩy rửa cần có hoạt tính cao ở pH kiềm. Nguyên liệu cho công nghiệp lên men sản xuất enzym phải đơn giản, rẻ tiền. Th−ờng dùng bột của các loại ngũ cốc hoặc rỉ đ−ờng, cao ngô. Sản xuất enzym công nghiệp có thể dùng ph−ơng pháp lên men xốp hay lên men chìm nh− đã mô tả ở Ch−ơng 3. Kỹ thuật lên men.
Ph−ơng pháp lên men xốp sản xuất enzym th−ờng áp dụng nuôi nấm mốc đã đ−ợc ứng dụng từ lâu ở một số n−ớc nh− Nhật Bản, các n−ớc vùng Viễn Đông để sản xuất amylase, protease, pectinase vμ cellulase.
Lên men chìm sản xuất enzym đ−ợc tiến hμnh trong các thiết bị giống nh− lên men sản xuất kháng sinh (hình 4.2).
Hình 4.2. Sơ đồ minh hoạ các giai đoạn sản xuất enzym dạng dung dịch
1. ống giống, 2. Nuôi trên máy lắc, 3. Bình nhân giống, 4. Thiết bị lên men chính, 5. Lọc hình trống, 6. Sinh khối, 7. Cột thẩm thấu ng−ợc, 8. Lọc vô khuẩn, 9. Làm lạnh và kết tủa bằng trống, 6. Sinh khối, 7. Cột thẩm thấu ng−ợc, 8. Lọc vô khuẩn, 9. Làm lạnh và kết tủa bằng NaCl, 10. Lọc thu sản phẩm, 11. Sấy khô, 12. Kiểm tra chất l−ợng, 13. Sản phẩm tinh khiết.
Môi tr−ờng lên men cũng bao gồm các chất cung cấp năng l−ợng nh−
hydrat carbon, nguồn nitơ, môi tr−ờng đ−ợc khử trùng trong thiết bị lên men, sau đó truyền giống vμ tiến hμnh lên men từ 30 - 150 giờ tuỳ theo chủng vi sinh vật. Công nghiệp sản xuất th−ờng sử dụng thiết bị từ 10 - 50 m3.
Enzym th−ơng phẩm đ−ợc sản xuất d−ới hai dạng: dạng bột khô vμ dạng lỏng, có thể lμ dạng thô hoặc dạng tinh khiết (hình 4.3).
Hình 4.3. Sơ đồ chiết xuất và tinh chế enzym
Tuy nhiên, dù sản xuất ở dạng nμo đi nữa nếu các enzym đó sử dụng trong thực phẩm hay y học đều phải thử độc tính của chúng rồi mới cho phép dùng. Trên thực tế để sản xuất enzym có độ an toμn cao cần chọn những vi sinh vật không tạo ra độc tố, đồng thời nguyên liệu dùng sản xuất cũng l−u ý đến việc có tạo ra độc tố hay không. Ví dụ, nếu nuôi Aspergillus flavus trên môi tr−ờng có khô lạc, hay bột lạc nhất định sẽ tạo ra aflatoxin lμ chất gây ung th− gan.
Cho đến nay mới chỉ có một số l−ợng nhỏ vi sinh vật đ−ợc sử dụng để sản xuất enzym. Vì vậy h−ớng nghiên cứu tìm kiếm enzym từ vi sinh vật vẫn còn lμ vấn đề thời sự vμ hấp đẫn.
5. Ph−ơng pháp bất động enzym (immobilised enzym)
Việc sử dụng enzym để phân giải cơ chất cần l−u ý đến tính chất sau đây của enzym để khỏi lãng phí: nếu enzym ở dạng hoμ tan hoặc tự do trộn vμo cùng với cơ chất để tiến hμnh phản ứng thì enzym chỉ sử dụng đ−ợc một lần. Vì khi phản ứng kết thúc ta không thể lấy lại enzym đó để sử dụng lần sau. Do đó kỹ thuật bất động enzym ra đời, về nguyên lý có thể mô tả tóm tắt nh−
sau: enzym đã tinh chế ở dạng tinh khiết đ−ợc gắn hoặc gói trong những polymer không hoμ tan trong n−ớc, hoặc hấp phụ trên các chất trơ vô cơ hoặc hữu cơ. Các hạt enzym nμy đ−ợc nhồi vμo các cột hình trụ có kích th−ớc thích hợp, sau đó cho dung dịch cơ chất chảy qua, enzym sẽ thực hiện phản ứng phân cắt cơ chất thμnh sản phẩm t−ơng ứng. Thu lấy sản phẩm để thực hiện các b−ớc tinh chế tiếp sau. Có thể bất động hoá các enzym hoặc các tế bμo vi sinh vật chứa enzym t−ơng ứng (hình 4.4).
Khi enzym hoặc tế bμo đã bất động hoá thì phản ứng phân giải cơ chất đ−ợc thực hiện liên tục với hiệu suất cao, nếu duy trì đ−ợc các điều kiện phản ứng không thay đổi thì quá trình có thể giữ đ−ợc hμng ngμn giờ, có những quá trình phản ứng kéo dμi đ−ợc 100 ngμy mới phải thay đổi enzym mới. Do đó enzym đ−ợc sử dụng nhiều lần, giá thμnh sản xuất một đơn vị sản phẩm sẽ giảm đi rất nhiều.
Enzym đ−ợc bất động bằng cách nμo? Trên thực tế sử dụng cả ph−ơng pháp vật lý vμ hoá học để bất động enzym.
Bằng ph−ơng pháp vật lý enzym có thể đ−ợc hấp phụ lên trên một cái khuôn không hoμ tan, hoặc đ−ợc gói vμo trong một gel, hoặc trong capsul thμnh các hạt vi nang, hoặc dán vμo phía sau một mμng bán thấm (hình 4.4).