- Các Cephalosporin thế hệ
3- Metyl glucosamin là đ−ờng loạ iL có chứa nhóm metylami nở C2.
Hai phần sau liên kết với nhau bằng dây nối glycosid tạo ra phân tử gồm hai loại đ−ờng đ−ợc gọi là streptobiosamin.
Streptomycin chỉ có hoạt tính khi phân tử còn nguyên vẹn. Nếu cắt bỏ phần nμo trong phân tử đều lμm kháng sinh mất tác dụng. Tuy nhiên nếu khử nhóm aldehyd (bằng H2/Pd) thμnh nhóm alcol tạo ra dihydrostreptomycin lại có tác dụng mạnh trên trực khuẩn lao nên dihydrostreptomycin đ−ợc sử dụng điều trị lao. Tuy nhiên sau nμy ng−ời ta nhận thấy dihydrostreptomycin tuy ít độc hơn streptomycin nh−ng lại dễ gây điếc hơn nên hiện nay không sử dụng nữa.
Streptomycin lμ bột trắng, không mùi, vị đắng, hút ẩm mạnh. Dễ tan trong n−ớc do có nhiều nhóm hydroxyl vμ amin, ít tan trong etanol, không tan trong ete vμ cloroform. Đ−ợc sử dụng nhiều hơn cả lμ dạng muối sulfat. Dạng muối nμy bền trong không khí vμ ánh sáng.
Streptomycin không hấp thu qua đ−ờng ruột nên dùng để tiêm bắp. Có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp protein của vi
(2)
(3) (1)
khuẩn. Phổ kháng khuẩn của streptomycin gồm các vi khuẩn Gram (-) hiếu khí vμ một số vi khuẩn Gram (+), streptomycin không có tác dụng trên các vi khuẩn kỵ khí.
2.3. Quy trình lên men sinh tổng hợp
2.3.1. Chủng giống
Trong sản xuất công nghiệp ng−ời ta sử dụng các biến chủng của
Streptomyces griseus nh− ATCC11429.
Xạ khuẩn S. griseus lμ vi sinh vật hiếu khí mạnh nên quá trình nuôi cấy cần lắc hoặc khuấy trộn kèm theo sục khí. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp từ 26 – 28OC. pH tối −u cho sự phát triển lμ 6,8 – 7,2. Thời gian lên men khoảng 96 – 120 giờ – 144 giờ.
2.3.2. Điều kiện lên men
Nguồn carbon: Nguồn hydratcarbon Str. griseus đồng hoá đ−ợc lμ tinh bột, dextrin, maltose, fructose… Chủ yếu sử dụng tinh bột vμ glucose vì cả 3 thμnh phần cấu tạo của Streptomycin đều có nguồn gốc từ glucose. Tuy nhiên ngoμi streptomycin trong môi tr−ờng lên men còn tạo thμnh manosidostreptomycin (hay còn gọi lμ streptomycin B) có hoạt tính kháng sinh yếu. Khi môi tr−ờng chứa quá nhiều glucose thì sẽ tạo thμnh một hỗn hợp không mong muốn của cả 2 loại streptomycin. Nguồn carbon vừa giúp cho vi sinh vật phát triển, cung cấp năng l−ợng cho vi sinh vật, đồng thời tham gia trực tiếp vμo phân tử kháng sinh streptomycin.
Nguồn nitơ: Nguồn nitơ vô cơ thích hợp lμ các muối amoni vμ không thích hợp với các muối nitrat.
Str. griseus còn có khả năng sinh tr−ởng vμ tạo kháng sinh streptomycin trên môi tr−ờng chứa protein nh− bột đậu t−ơng, bột cá, men khô, gluten bột mì vì loμi xạ khuẩn nμy có hệ protease mạnh nên có khả năng phân huỷ các protein thμnh các acid amin vμ sử dụng các acid amin nμy trong quá trình trao đổi chất.
Nguồn phospho: Cần phospho vô cơ hoμ tan có trong KH2PO4 để cho giống sinh tr−ởng vμ phát triển bình th−ờng. Thiếu phospho hoμ tan thì sinh tr−ởng của khuẩn ty yếu do sự đồng hoá carbon vμ nitơ bị chậm vμ hoạt lực kháng sinh thấp. Tuy nhiên thừa phospho sẽ tăng nhanh tốc độ sử dụng hydratcarbon lμm cho quá trình tạo bμo tử rút ngắn, do đó ức chế sự tổng hợp streptomycin.
NaCl: Thực nghiệm cho thấy thêm NaCl vμo môi tr−ờng lên men thì hiệu suất sinh tổng hợp streptomycin tăng. Có lẽ NaCl có tác dụng lμm thay đổi tính thấm của thμnh tế bμo nên kháng sinh tiết vμo môi tr−ờng dễ dμng hơn vμ không gây ức chế lên chủng sinh streptomycin.
CaCO3: Trong môi tr−ờng nuôi cấy cần có CaCO3 với mục đích lμm ổn định pH.
Nguồn kim loại vi l−ợng: Chủng xạ khuẩn sinh streptomycin cũng cần một số kim loại nh− Mg, Mn, Fe, Cu… vμ th−ờng đ−ợc bổ sung d−ới dạng muối sulfat. Nếu môi tr−ờng có cao ngô, bột đậu, bột lạc… thì không cần bổ sung vì bản thân các loại nguyên liệu nμy đã sẵn có các muối kim loại.
Quá trình lên men kéo dμi khoảng 120 - 144 giờ, nhiệt độ thích hợp 26 - 28OC, pH môi tr−ờng 6,8 - 7,2. Cấp khí với l−u l−ợng 1 VVM. ở pha phát triển thứ nhất, chủng xạ khuẩn nμy sinh tr−ởng mạnh sau 6 - 8 giờ. Các bμo tử nảy chồi, mỗi bμo tử nảy 1 chồi tạo thμnh hệ sợi. Khuẩn ty thẳng vμ phân nhánh yếu, tế bμo chất −a kiềm. B−ớc sang pha lên men thứ hai quá trình phát triển chậm lại hệ sợi không phát triển nữa mμ b−ớc vμo giai đoạn tự phân ở ngμy thứ 3 (khoảng 72 giờ). Chủng Str. griseus rất nhạy cảm với phage, do đó quá trình lên men cần giữ vô khuẩn rất chặt chẽ vμ cần kiểm tra độ vô trùng 4 giờ/lần.
Trong điều kiện tối −u hiệu suất sinh tổng hợp tạo streptomycin của xạ khuẩn Str. griseus đạt tới 20.000 – 25.000 đv/ml môi tr−ờng.
Các môi tr−ờng sinh tổng hợp có thμnh phần nh− sau:
Môi tr−ờng giữ giống (%)
Glucose 2,0 Pepton 0,5 Cao thịt 0,5 NaCl 0,5 Agar – agar 2,0 pH 6,8 – 7,2 Khử trùng 115OC trong 20 phút. Nhiệt độ nuôi cấy 28OC
Thời gian nuôi cấy 5 –7 ngμy.
Môi tr−ờng nhân giống (%) Glucose 4,0 Bột đậu 3,0 (NH4)2SO4 0,6 NaCl 0,3 CaCO3 0,6 KH PO 0,01
Dầu phá bọt 0,5 pH 6,8 – 7,2
Khử trùng bằng hơi nóng ở 120OC trong 60 phút. Khi môi tr−ờng hạ nhiệt độ xuống 28 - 30OC thì cấy giống vμo với tỷ lệ 0,5 lít/600 lít môi tr−ờng. Giống đ−ợc nuôi trong vòng 40 – 48 giờ ở nhiệt độ 28OC. Cấp khí vô trùng với l−u l−ợng 1 VVM. Máy khuấy với tốc độ 110 vòng/phút. Phá bọt tự động bằng dầu lạc đã khử trùng.
Giống đ−ợc truyền sang nồi nhân giống cấp 2 vμ đ−ợc nuôi d−ỡng trong điều kiện nh− trên trong thời gian 36 – 40 giờ.
Môi tr−ờng lên men tạo streptomycin (%) Glucose 4,0 Bột đậu 3,0 (NH4)2SO4 0,6 NaCl 0,25 CaCO3 0,6 KH2PO4 0,01 Dầu phá bọt 0,2 pH 6,8 – 7,2
Môi tr−ờng đ−ợc chuẩn bị trong nồi pha chế, sau đó bơm qua cột khử trùng liên tục ở 134OC. Khi môi tr−ờng hạ nhiệt độ xuống 28 – 30OC thì truyền giống từ nồi ủ sang bằng khí nén vô trùng.
Tiến hμnh lên men kháng sinh trong điều kiện nhiệt độ 28OC trong thời gian 120 – 144 giờ. Cấp khí vô trùng với l−u l−ợng 0,5 – 1VVM. Máy khuấy với tốc độ 110 vòng/phút. Phá bọt tự động bằng dầu lạc đã khử trùng. Cứ 4 giờ lấy mẫu phân tích 1 lần để kiểm tra độ vô trùng, có nhiễm phage hay không? Có cần bổ sung thμnh phần gì vμo môi tr−ờng nuôi cấy hay không? Cần kiểm soát chặt chẽ hμm l−ợng glucose trong môi tr−ờng lên men để thu đ−ợc chủ yếu streptomycin A.
Hiện nay ng−ời ta vẫn ch−a xác định đ−ợc tiền chất trong quá trình sinh tổng hợp streptomycin.
2.4. Quy trình chiết xuất kháng sinh Streptomycin
Streptomycin lμ chất kháng sinh có tính base yếu nên có thể sử dụng cacboxycationit dạng Na+ để tách chiết sản phẩm. Quá trình hấp phụ của Streptomycin trên cationit có thể biểu diễn bằng ph−ơng trình:
Dịch lên men đ−ợc xử lý tr−ớc khi tách chiết kháng sinh bằng cách acid hoá bằng dung dịch H2SO4 30% đến pH 2,5 - 3,0. Khuấy nhẹ để cho quá trình kết tủa tốt hơn. Lọc trên lọc ép khung bản, hay lọc trống quay loại sinh khối. Khuẩn ty Str. griseus rất mảnh nên quá trình lọc cần cho chất trợ lọc.
Khả năng hấp phụ của streptomycin phụ thuộc vμo l−ợng tạp chất có trong dịch lên men, đặc biệt lμ các cation Mg++, Ca++ vì vậy phải loại các ion đó tr−ớc khi hấp phụ kháng sinh bằng cách thêm oxalat natri vμo dịch lọc. Khuấy 30 phút. Lọc loại tủa. Dịch lọc bơm vμo thiết bị chứa vμ hạ nhiệt độ đến 8°C. Thêm 1% formalin để bảo quản. Trung tính bằng NaOH đến pH = 7,0 - 7,5. Dịch đã tinh chế lọc qua bông thuỷ tinh rồi đem hấp phụ trên cột.
Dịch lọc chứa kháng sinh cho hấp phụ trên cột với tốc độ 800 lít/giờ. Thời gian bão hoμ cột khoảng 24 giờ. Khi nμo dịch chảy qua còn khoảng 100 đv/ml thì ngừng. Rửa cột bằng n−ớc mềm để loại tạp chất hữu cơ vμ sắc tố. Hiệu suất giai đoạn hấp phụ đạt 95%. Phản hấp phụ streptomycin bằng H2SO4 5%, quá trình phản hấp phụ đ−ợc biểu diễn bằng ph−ơng trình:
R3(Strep) + 3H+ 3RCOOH + (Strep)3+
Tảy màu Loại muối (cationit) Trung hoà (anionit) cô chân không
anionit 95.000UI/ml 60.000UI/ml; pH = 2,0 + Na 2 CO 3 500UI/ml, pH = 2,0 5.000UI/ml <50UI/ml H 2 SO 4 5% cacboxycationit Loại Ca, Mg trung hoà Loại protein Lọc Làm lạnh pH 2,5 - 3 Lọc streptomycin P/đoạn 1 P/đoạn 5 P/đoạn 2 P/đoạn 4 tinh chế P/đoạn 3 phản hấp phụ hấp phụ sinh khối Dịch lọc dịch lên men lọc
Phân loại dịch phản hấp phụ ra các phân đoạn vμ có chế độ xử lý khác nhau tuỳ theo hμm l−ợng kháng sinh trong các phân đoạn đó:
Phân đoạn 1: Cho chảy vμo ống thoát đến khi khi hoạt tính đạt 50 đv/ml.
Phân đoạn 2: Có hoạt tính thấp, từ 50 - 20.000 đv/ml. Hoạt tính trung bình 5000đv/ml vμ có pH 3,5. Đem hấp phụ trở lại để thu hồi.
Phân đoạn 3: Có hoạt tính cao từ 20.000 đv/ml trở lên. Trung bình lμ
95.000 đv/ml vμ pH = 6,5. Tinh chế tiếp bằng than hoạt.
Phân đoạn 4: Phần có hoạt tính cao vμ pH = 2,0. Hoạt tính trung bình 60.000 đv/ml đ−ợc trung tính hoá bằng anionit dạng OH–.
Phân đoạn 5: Hoạt tính thấp vμo khoảng 500đv/ml vμ pH = 2,0. Trung hoμ bằng Na2CO3 rồi hấp phụ lại để thu hồi.
Phân đoạn 3, 4 đ−ợc tẩy mμu bằng than hoạt với l−ợng 2,5 - 3% (tính theo trọng l−ợng kháng sinh). Lọc loại than. Rửa than bằng n−ớc mềm để lấy hết kháng sinh. Hiệu suất 96% (tính từ dịch đem tẩy mμu). Dịch kháng sinh đã tẩy mμu cho chảy qua cột trao đổi ion để loại muối. Ph−ơng trình loại muối nh− sau:
R - SO3H + Na+ R – SO3Na+ + H+
Do xuất hiện ion H+ nên dung dịch kháng sinh có pH acid. Dịch lại đ−ợc trung tính hoá bằng cột anionit.
2R - NH4OH + SO42- (RNH3)2SO4 + H+
Dung dịch streptomycin đã loại muối vμ trung tính hoá đ−ợc bốc hơi trong chân không ở 740 - 750 mmHg đến đậm độ 170.000 - 210.000 đv/ml, sau đó phun sấy để thu bột streptomycin. Đóng gói trong điều kiện tuyệt đối vô trùng.