- Các Cephalosporin thế hệ
1. Sinh tổng hợp Polymyxin
1.1. Đại c−ơng
Polymyxin lμ tên gọi của một nhóm kháng sinh có cấu trúc polypeptid do vi khuẩn Bacillus polymyxa vμ Bacillus circulans tạo ra. Năm 1947, ba nhóm các nhμ khoa học gồm nhóm Ainsworth, nhóm Benedict vμ nhóm Stansly đã phân lập đ−ợc từ chủng vi khuẩn Bacillus polymyxa một hỗn hợp gồm 5 polymyxin A, B, C, D vμ E. Các nghiên cứu sau nμy cho thấy polymyxin B, D vμ E lại chia ra B1 - B2, D1 – D2 vμ E1 - E2. Danh sách các polymyxin đ−ợc tìm thấy từ các chủng vi khuẩn ngμy cμng nhiều nh− polymyxin M, polymyxin F1, F2, F3… Do độc tính cao đối với thận nên chỉ 2 trong các chất trên lμ
polymyxin B vμ polymyxin E đ−ợc dùng d−ới dạng muối sulfat để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Gram (-).
Đến năm 1950, Koyama vμ cộng sự đã chiết đ−ợc từ môi tr−ờng nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus colistinus chất colistin (hay colimyxin) bao gồm 3
chất colistin A, B vμ C có hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp 4 lần polymyxin mμ độc tính lại thấp hơn. Các phân tích về cấu trúc hoá học sau nμy cho thấy colistin A chính lμ polymyxin E1.
1.2. Cấu trúc hoá học vμ tính chất
Các polymyxin đã đ−ợc nghiên cứu kỹ, riêng polymyxin B, đã tổng hợp đ−ợc. Về cấu tạo chúng lμ 1 polypeptit vòng chỉ khác nhau về thμnh phần vμ số l−ợng acid amin. Phân tử polymyxin M có chứa D-leucin, 3 gốc treonin vμ 6 gốc acid α, γ diaminobutyric (DAB). Ngoμi ra còn chứa 1 gốc acid -6-metyloctanoic.
γ Thr DAB NH2 DAB Y X D DAB DAB Z γ NH2 Thr DAB R NH2 γ NH2 γ Tên R X Y Z
Polymyxin B1 (+)-6-methyloctanoyl Phe Leu DAB Polymyxin B2 6-methylheptanoyl Phe Leu DAB Polymyxin D1 (+)-6-methyloctanoyl Leu Thr D-Ser Polymyxin D2 6-methylheptanoyl Leu Thr D-Ser
Thr DAB NH2 DAB Leu Leu D DAB DAB DAB γ NH2 Thr DAB R NH2 γ NH2 γ γ Tên R
Polymyxin E1 hay Colistin A (+)-6-methyloctanoyl
Polymyxin E2 6-methylheptanoyl
Polymyxin M
Hình 13.1. Cấu trúc hoá học của một số polymyxin theo Merck Index 1996
Các polymyxin có tác dụng diệt khuẩn, thuốc gắn vμo phospholipid lμm thay đổi tính thấm vμ thay đổi cấu trúc mμng tế bμo của vi khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn của polymyxin B chỉ giới hạn trên một số chủng vi khuẩn Gram (-) nh− E. coli, Aerobacter aerogenes, Salmonella, Proteus… vμ đặc biệt trên trực khuẩn mủ xanh Ps. aeruginosa. Trong y học polymyxin B đ−ợc dùng tại chỗ, đơn độc hay phối hợp với một số hợp chất khác nh− neomycin sulfat, oxytetracyclin, hydrocortison… điều trị nhiễm khuẩn mắt, tai mũi họng vμ
một số nhiễm khuẩn khác. Polymyxin E hay colistin đ−ợc dùng trong y học d−ới dạng muối sulfat để điều trị tại chỗ nhiễm khuẩn đ−ờng tiết niệu hay đ−ờng tiêu hoá. Dạng muối colistin natri mesilat đ−ợc dùng dạng tiêm để điều trị nhiễm khuẩn huyết, viêm mμng não, nhiễm khuẩn thận… vμ chỉ sử dụng khi không dùng đ−ợc những thuốc khác do độc tính cao.
1.3. Điều kiện lên men
Để sinh tổng hợp polymyxin ng−ời ta nuôi cấy B. polymyxa trên môi tr−ờng thạch có thμnh phần (%): Cao ngô 0,5 Cao nấm men 0,5 Glucose 2,0 Agar 2,0 pH 6,8 ữ 7,2
Khử trùng 110°C/20 phút. Nuôi ở 28°C trong thời gian 24 giờ. Môi tr−ờng nhân giống gồm (%):
Cao ngô 1,0 Bột đậu t−ơng 1,0 Glucose 2,0 Sulfat amoni 0,3 pH 6,8 ữ 7,2
Khử trùng 115°C/20 phút. Cấy giống vμo vμ nuôi 18- 20 giờ/28°C. Môi tr−ờng lên men tạo kháng sinh có thμnh phần (%):
Cao ngô 1,0 Bột đậu t−ơng 2,0 Glucose 3,0
vμ một số muối: MgSO4. 7H2O; KH2PO4; NaCl ...
Khử trùng môi tr−ờng vμ cấy giống vμo với l−ợng 2 ữ2,5%. Tiến hμnh lên men ở điều kiện: nhiệt độ 28 - 30°C. Thông khí với l−u l−ợng 1VVM. Thời gian
1.4. Chiết xuất polymyxin từ môi tr−ờng lên men
Trong công nghiệp để chiết polymyxin đã sử dụng ph−ơng pháp trao đổi ion. Bản chất hoá học của kháng sinh lμ polypeptid. Các acid amin trong phân tử polymyxin có chứa các nhóm amin tự do, có khả năng trao đổi với nhóm carboxyl của phân tử nhựa loại carboxycationit. Nh− KB-2, KB-HP-2, Amberlit, IRC-50 ... Quá trình chiết có thể tiến hμnh nh− sau:
Dịch lên men xong đ−ợc acid hoá đến pH 3,5 ữ 4,0 để giải phóng kháng sinh (có thể sử dụng acid oxalic để loại ion calci). Lọc loại sinh khối. Dịch lọc trung hoμ bằng NaOH. Có thể chiết polymyxin từ dịch lọc nμy bằng dung môi hữu cơ n-butanol. Sau đó kết tủa bằng aceton.
Dịch lọc đã trung hoμ đ−ợc lọc qua bông thuỷ tinh đến trong suốt rồi bơm qua các cột trao đổi ion dạng Na+(R-COO-Na+). Cột đã bão hoμ kháng sinh rửa bằng n−ớc cất hay n−ớc đã khử khoáng.
Phản hấp phụ kháng sinh bằng acid hydrocloric hay sulfuric 10%. Dịch phản hấp phụ tẩy mμu bằng than hoạt, lọc loại than. Dịch lọc đem loại các cation kim loại bằng sulfocationit ví dụ: KU-2-20 hay SBS - 1. Trung hoμ dịch bằng cách cho chảy qua cột anionit dạng OH–.
Dịch kháng sinh đã trung hoμ đ−ợc bốc hơi trong chân không ở nhiệt độ ≤ 35°C, áp suất 10 – 15 mmHg. Sau đó phun sấy để thu lấy kháng sinh.