- Các Cephalosporin thế hệ
4. Sinh tổng hợp Clotetracyclin
4.1. Chủng giống
Clotetracyclin còn có tên khác lμ biomycin, aureomycin vμ đ−ợc tìm ra lần đầu vμo năm 1948 trong môi tr−ờng nuôi cấy chủng xạ khuẩn Str. aureofaciens. Trong sản xuất công nghiệp hiện nay ng−ời ta sử dụng một số biến chủng cho hiệu suất sinh tổng hợp cao nh−Str. aureofaciens A377 (NRRL 2009), Str. aureofaciens ATCC 13908-13911.
Muối clohydrat của clotetracyclin lμ dạng bột tinh thể mμu vμng, không mùi, vị đắng, bền vững trong không khí khô ở nhiệt độ phòng, nếu để ra ánh sáng thì dần dần mất hoạt tính. Clotetracyclin bền trong dung dịch acid (pH 0,6 – 2,6), không bền trong dung dịch kiềm.
4.2. Điều kiện lên men
Nhu cầu dinh d−ỡng vμ điều kiện lên men sinh tổng hợp của chủng
Str. aureofaciens mang những đặc điểm chung nh− phần tổng quan nêu trên. Tuy nhiên cần chú ý thêm một số yếu tố riêng nh− sau:
Thμnh phần môi tr−ờng lên men (%):
Bột ngô 12,0 Cao ngô 0,5 (NH4)2SO4 1,5 NaCl (hoặc NH4Cl, NH4NO3) 0,6 Muối khoáng … 0,01 CaCO3 1,5
pH sau khử trùng 6,6 - 7,2 Nhiệt độ nuôi cấy 28OC
Thời gian lên men 100-120 giờ Cung cấp khí vô trùng 1VVM
Môi tr−ờng lên men phải cung cấp ion clo để tạo Clotetracyclin. Thích hợp nhất lμ amoni clorid, natri clorid hoặc amoni nitrat.
Các tiền chất sử dụng trong sinh tổng hợp clotetracyclin lμ các hợp chất mạch vòng, thích hợp nhất lμ benzylthioxyanid (C6H5CH2-SCN) với hμm l−ợng 1-3 mg/l môi tr−ờng có thể lμm tăng hiệu suất đến 30 - 40%.
4.3. Ph−ơng pháp chiết xuất
Có thể sử dụng ph−ơng pháp kết tủa để thu clotetracyclin từ dịch lên men theo sơ đồ hình 9.3a. Các b−ớc tiến hμnh nh− sau:
Dịch lên men đ−ợc hạ nhiệt độ xuống 15OC. Sau đó acid hoá bằng H2SO4 30% đến pH = 4,5. Lọc loại sinh khối vμ thêm 0,1% CaCl2. Kiềm hoá bằng NH4OH đến pH 8,5 – 9 kháng sinh sẽ kết tủa dạng phức calci. Lọc thu kết tủa để tinh chế tiếp qua các công đoạn loại tạp, tẩy mμu…
Clotetracyclin có hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp 4 lần tetracyclin (Test lμ Staphyloccocus aureus) song độc tính cao hơn Tetracyclin nên hiện không dùng trong y học. Tr−ớc đây có sử dụng chế phẩm mỡ tra mắt (dạng clohydrat) vμ viên nén (dạng base). Hiện nay clotetracyclin đ−ợc sản xuất dạng thô (chế phẩm Biovit) dùng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm.
Qui trình sản xuất Biovit: Có thể áp dụng một trong hai quy trình sau (hình 9.3b vμ c): sấy phun dịch lên men acid hóa lọc kết tủa tinh chế sản phẩm lọc sấy Làm lạnh 15oC H2SO4 30% pH = 4 - 5 CaCl2 NH4OH Loại tạp Ca, Mg Tảy màu <60oC 600mmHg cô biovit Còn 40% sinh khối (a) (b) (c)
Hình 9.3. Quy trình xử lý dịch lên men clotetracyclin
(a): Quy trình thu clotetracyclin tinh khiết (b, c): Quy trình thu biovit
Dịch lên men đ−ợc cô chân không đến 40% chất đặc, sau đó sấy phun thu sản phẩm. Hoặc dịch lên men đem lọc lấy sinh khối (Biomaca) vμ sấy chân không ở nhiệt độ ≤ 60°C vμ p = 600 mmHg. Sau đó xay thμnh bột, xác định hoạt tính kháng sinh của bột nμy để phân loại sản phẩm. Có các loại Biovit 80, Biovit 120 hay Biovit 150 (Mỗi kg Biovit có chứa 80, 120 hay 150 g biomyxin vμ 4 mg vitamin B12).