Danh sách các chất kháng sinh đ−ợc phát minh ngμy cμng dμi thêm mãi. Việc phân loại các kháng sinh lμ cần thiết vì nó giúp cho các nhμ khoa học tốn ít thời gian khi nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng, độc tính...
Có thể phân loại kháng sinh theo nguồn gốc (kháng sinh do xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm) tạo ra. Song có chất kháng sinh do một vμi loμi vi sinh vật cùng tạo ra thì xếp sắp thế nμo, do đó cách sắp xếp nμy không thích hợp. Có thể phân loại kháng sinh theo cơ chế tác dụng (kháng sinh tác dụng lên thμnh tế
bμo, lên tổng hợp protein, tổng hợp ADN, ARN ...). Cách phân loại nμy thích hợp cho các nhμ D−ợc lý học. Các nhμ Hoá học thì đề nghị phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học lμ
khoa học nhất vì nó giúp cho ng−ời nghiên cứu nhanh chóng định h−ớng đ−ợc các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết đ−ợc cấu trúc hoá học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học th−ờng chia ra các nhóm chất sau đây:
+ Các chất kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin) + Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)
+ Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) + Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (các tetracyclin)
+ Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin) + Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin) + Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)
+ Các kháng sinh chống ung th− nhóm antracyclin (daunorubicin) + Các kháng sinh chống ung th− nhóm actinomycin (dactinomycin D) + …
4. Các ph−ơng pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh
Để phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh ng−ời ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, đất nền ở chuồng gia cầm, gia súc, bùn, n−ớc ở sông hồ... Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những vi sinh vật sinh kháng sinh mμ ta mong muốn bằng các ph−ơng pháp đặc tr−ng vμ trên các môi tr−ờng chọn lọc.
Để phân lập xạ khuẩn th−ờng dùng môi tr−ờng có thμnh phần sau:
Môi tr−ờng 1 Môi tr−ờng 2 (NH4)2SO4 K2HPO4 NaCl MgSO4 Tinh bột Agar – agar N−ớc máy vừa đủ 1 g 1 g 1 g 1 g 10 g 20 g 1.000 ml KNO3 K2HPO4 NaCl MgCO3 Tinh bột FeSO4 CaCO3 Agar - agar N−ớc máy vừa đủ 1 g 3 g 0,2 g 0,3 g 10 g 0,001 g 0,5g 20 g 1.000 ml pH tr−ớc khi tiệt trùng 6,8 ữ 7,0
Để phân lập nấm mốc th−ờng sử dụng môi tr−ờng có thμnh phần: NaNO3 KH2PO4 MgSO4 Saccharose Agar – agar N−ớc máy vừa đủ 6 g 1 g 0,05 g 20 g 20 g 1.000 ml pH tr−ớc khi tiệt trùng 6,0 ữ 6,2.
Ví dụ: Đa số vi khuẩn phát triển tốt trên môi tr−ờng có thμnh phần giμu dinh d−ỡng (pepton, canh thang - thạch) ở pH 7,0 vμ nhiệt độ 30 ữ 37°C. Trong các điều kiện trên nấm mốc vμ xạ khuẩn phát triển chậm hơn.
Có thể khái quát hoá thμnh nguyên tắc để thực hiện dễ dμng nh− sau:
1. Mỗi chất kháng sinh đ−ợc tạo ra bởi một hoặc vμi loμi vi sinh vật xác định. Ví dụ: tetracyclin do Str. aureofaciens, Str. viridifaciens tạo ra; penicillin do P. chrysogenum hoặc P. notatum tạo ra.
2. Mỗi loμi vi sinh vật xác định có thể sinh tổng hợp ra một hoặc vμi chất kháng sinh theo đặc điểm di truyền của chúng. Ví dụ: Str. fradiae có thể tạo ra neomycin A, neomycin B, neomycin C. Str. rimosus tạo ra oxytetracyclin … Biết đ−ợc nguyên tắc trên việc đi tìm các kháng sinh đã đ−ợc mô tả rất dễ dμng. Ví dụ: muốn có kháng sinh streptomycin chỉ cần phân lập xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
vμ loμi lμ griseus. Muốn có kháng sinh fumagillin ta cần phân lập nấm mốc thuộc chi Aspergillus vμ loμi fumigatus. Muốn có kháng sinh gramyxidin chỉ cần phân lập vi khuẩn có bμo tử chi Bacillus loμi
brevis...
Rõ rμng để phân lập một vi sinh vật cho một chất kháng sinh đã biết công việc không phức tạp lắm, song để phân lập những vi sinh vật sinh chất kháng sinh mới đòi hỏi công việc phức tạp hơn nhiều, nhất lμ những kháng sinh chống virus vμ ung th−.
4.1. Ph−ơng pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch
Cân chính xác một l−ợng đất, nghiền trong cối sứ với một l−ợng n−ớc, sau đó cho vμo bình lắc khoảng 5 phút. Dùng n−ớc vô trùng pha loãng thμnh những nồng độ cần thiết. Nhỏ dung dịch đã pha loãng lên môi tr−ờng thạch dinh d−ỡng gạt nhẹ lên bề mặt thạch cho phân tán đều. Nuôi trong tủ ấm 30°C, sau một thời gian 3 - 5 ngμy xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ. Cấy tách khuẩn lạc đó lên thạch nghiêng cho thuần khiết, sau đó nghiên cứu hoạt tính kháng sinh của các vi sinh vật phân lập đ−ợc.
4.2. Ph−ơng pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn vi sinh vật kiểm định sinh vật kiểm định
Trên hộp petri có môi tr−ờng dinh d−ỡng vμ chứa vi sinh vật kiểm định, đem gieo cấy trực tiếp các "hạt" đất lên bề mặt thạch, để tủ ấm 24 - 48 giờ mang ra quan sát. Nếu xung quanh các hạt đất có vòng vô khuẩn, ta biết đ−ợc vi sinh vật trong hạt đất đó có sinh ra chất kháng sinh chống lại vi sinh vật kiểm định. Từ cục đất đó ta tiến hμnh phân lập vμ đ−ợc vi sinh vật sinh kháng sinh để nghiên cứu tiếp. Ph−ơng pháp nμy cho biết đ−ợc ngay lμ vi sinh vật đối kháng phân lập đ−ợc có khả năng ức chế đ−ợc vi sinh vật gây bệnh thuộc loại gì.
4.3. Ph−ơng pháp lμm giμu đất
Đất tr−ớc khi đem phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh đ−ợc đ−a vμo chậu thuỷ tinh, giữ độ ẩm xác định - thỉnh thoảng ta lại cho thêm một ít vi sinh vật kiểm định vμo, trộn đều. Nuôi ở tủ ấm sau một thời gian đem ra phân lập theo ph−ơng pháp nêu ở mục 4.1. Bằng ph−ơng pháp nμy ng−ời ta dễ dμng thu đ−ợc vi sinh vật đối kháng với vi sinh vật kiểm định mặc dù ban đầu vi sinh vật đối kháng đó có trong đất rất ít.
4.4. Ph−ơng pháp thêm kháng sinh vμo trong môi tr−ờng phân lập
Xạ khuẩn phát triển chậm hơn vi khuẩn vμ nấm mốc. Vì vậy để dễ dμng phân lập xạ khuẩn, ng−ời ta cho thêm kháng sinh chống nấm vμ kháng khuẩn với nồng độ từ 5 - 25 mcg/ml vμo môi tr−ờng phân lập. Các kháng sinh th−ờng dùng lμ: tetracyclin, neomycin, nystatin, streptomycin, penicillin, chloramphenicol. Bằng cách nμy ng−ời ta dễ dμng phân lập đ−ợc xạ khuẩn sinh chất kháng sinh.
4.5. Phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh chống ung th−
Hầu hết các kháng sinh chống ung th− vừa có tác dụng tiêu diệt tế bμo ung th−, lại vừa có tác dụng tiêu diệt tế bμo vi khuẩn. Vì vậy để sμng lọc các vi sinh vật tạo ra kháng sinh chống ung th− ta có thể dùng vi khuẩn lμm mô hình để thử ban đầu, vừa đỡ nguy hiểm vừa đỡ tốn kém. Nguyên lý của ph−ơng pháp có thể tóm tắt nh− sau: trao đổi chất của tế bμo ung th− khác với tế bμo bình th−ờng. Sự khác biệt đó đ−ợc đặc tr−ng ở bộ máy hô hấp của tế bμo, đo c−ờng độ hô hấp của tế bμo nhận thấy c−ờng độ hô hấp của tế bμo ung th− thấp hơn nhiều so với tế bμo bình th−ờng. Trên cơ sở đó Gauze (1958) đã nêu ý kiến dùng tác nhân gây đột biến các tụ cầu để nhận đ−ợc các chủng đột biến có c−ờng độ hấp thu oxy thấp hơn chủng ban đầu từ 20-80% lμm vi sinh vật kiểm định để thử tác dụng chống ung th− của kháng sinh. Umesawa (1961) đã sử dụng các nấm men đột biến có c−ờng độ hô hấp thấp lμm test để thử tác dụng chống ung th− của kháng sinh. Sau đó so sánh độ nhạy của ph−ơng pháp dùng tế bμo ung th− vμ tế bμo của vi sinh vật đột biến nhận thấy
dùng vi sinh vật đột biến có độ nhạy hơn. Khi đã chọn lọc ban đầu đ−ợc chất kháng sinh chống ung th− rồi, cần phải thử tiếp trên các dòng tế bμo ung th−
in vitro vμ in vivo để khẳng định chính xác xem chất kháng sinh tìm thấy có tác dụng trên tế bμo ung th− hay không? Công việc nμy hiện nay thực hiện t−ơng đối dễ dμng vì đã có nhiều dòng tế bμo ung th− đ−ợc nuôi cấy thuần chủng trong phòng thí nghiệm.
5. Ph−ơng pháp gây đột biến vi sinh vật để nâng cao hiệu
suất
Vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh phân lập đ−ợc từ cơ chất thiên nhiên th−ờng có hoạt tính rất thấp. Ví dụ: các chủng Penicillium phân lập từ đất chỉ đạt từ 30 - 50đv/ml dịch nuôi cấy. Vì vậy để thu đ−ợc các chủng có hoạt tính cao đ−a vμo sản xuất đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các ph−ơng pháp khác nhau vμ nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp.
5.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc tự nhiên
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh gấp 10 - 20 lần những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.
Tiến hμnh cấy giống trên hộp petri sao cho mỗi hộp chỉ có 10 - 20 khuẩn lạc tách riêng biệt, sau đó tiến hμnh kiểm tra hoạt tính kháng sinh của chúng bằng các cách sau:
− Đổ lớp thạch có chứa vi khuẩn kiểm định lên bề mặt hộp petri đã nuôi vi sinh vật sinh kháng sinh. Đặt hộp petri vμo tủ ấm, 24 giờ sau đọc kết quả. Vòng ức chế cμng lớn hoạt tính kháng sinh do khuẩn lạc tạo ra cμng mạnh.
− Có thể khoan các cục thạch có chứa các khuẩn lạc vi sinh vật sinh kháng sinh đặt lên hộp petri khác đã chứa sẵn vi sinh vật kiểm định, sau đó nuôi ở tủ ấm 24 giờ vμ đọc kết quả. Từ khuẩn lạc có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất cấy ra thạch nghiêng để nghiên cứu tiếp tục. Waskman N.S. vμ cộng sự (1946) đã sử dụng streptomycin cho vμo môi tr−ờng nuôi cấy Str. griseus lμ xạ khuẩn sinh ra streptomycin với nồng độ 100 mcg/ml. Kết quả cho thấy chỉ những cá thể nμo có khả năng tạo ra streptomycin với nồng độ lớn hơn 100 mcg/ml mới sống sót vμ phát triển. Đây cũng lμ ph−ơng pháp để chọn các chủng cho hoạt tính cao.
Trong thực tế việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có hoạt tính cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vμo sản xuất. Để thu đ−ợc những chủng có khả năng siêu tổng hợp chất kháng sinh ng−ời ta áp dụng ph−ơng pháp đột biến nhân tạo.
5.2. Đột biến nhân tạo
Các tác nhân gây đột biến mạnh nh− tia UV, X hay những hoá chất: iperit, ethylenimin, dimethylsulfat... Cho tác dụng với liều l−ợng vμ thời gian thích hợp sẽ giết chết các vi sinh vật. Những cá thể nμo nếu còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, lμm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc lμ mất khả năng tạo ra kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc lμm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến d−ơng tính).
Bảng 7.1. Kết quả chọn giống các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh Hiệu suất tạo kháng sinh (đv/ml) Vi sinh vật sinh
kháng sinh
Tác nhân
gây đột biến Chủng ban đầu Chủng sau gây đột biến
Penicillin R, UV, I, EI 220 5200 Streptomycin R, UV 250 4200 Clotetracyclin R, UV 600 2200 Erythromycin UV, EI 500 1000 Chú thích: R - Rơnghen UV - Cực tím I - Iperit EI - Etylenimin
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hμnh đột biến bậc thang, kết hợp với các ph−ơng pháp di truyền phân tử nh−
tái tổ hợp định h−ớng các gen. Kĩ thuật tách dòng gen, kĩ thuật tạo vμ dung hợp tế bμo trần đã đem lại nhiều kết quả không những nâng cao đ−ợc hiệu suất sinh tổng hợp của chủng giống mμ còn rút ngắn đ−ợc thời gian tạo giống mới. Sơ đồ chọn giống bậc thang P. chrysogenum NRRL 1951 cho thấy sự phức tạp của công việc vμ lòng kiên trì không biết mệt mỏi của các nhμ nghiên cứu để đạt đ−ợc hiệu quả cho một chủng giống dùng trong công nghiệp sản xuất penicillin (hình 7.1).