4 Vitamin B12c Nitrosocobalamin NO 5 Coenzym B 12 5'-deoxy-adenosylcobalamin
4.4. Quy trình sản xuất
Môi tr−ờng thạch giữ giống có thμnh phần gồm (%):
Glucose 3,0 Cao ngô 0,5 KH2PO4 0,1 CoCl2. 6H2O 0,01 Agar-agar 1,0 pH 6,8 ữ 7,2
Khử trùng 110°C/20 phút, cấy vi khuẩn vμ nuôi trong điều kiện kỵ khí bắt buộc ở 30°C trong 72 giờ.
Môi tr−ờng nhân giống (%):
Glucose 3,0
Cao ngô 1,5
CoCl2. 6H2O 0,015 pH 6,8 ữ 7,2.
Khử trùng 115°C/30'. Nuôi giống trong điều kiện kỵ khí ở 30°C/48 giờ. Cấy giống với tỷ lệ 10% lμ thích hợp.
Môi tr−ờng lên men tạo vitamin B12 (%):
Glucose 8,0
Cao ngô 2,5
CoCl2. 6H2O 0,015
5,6 DMB 0,015
pH 6,8 ữ 7,2
Khử trùng 115°C/30 phút. Lên men trong 6 - 7 ngμy.
Vi khuẩn Propionibacterium shermanii sống kỵ khí tuỳ thích nh−ng không thể phát triển đ−ợc trong điều kiện hiếu khí mạnh. Hμm l−ợng vitamin B12 tạo thμnh nhiều trong điều kiện kỵ khí, do đó trong 50h đầu nếu hiếu khí sẽ lμm giảm sinh khối vμ hiệu suất sinh tổng hợp. Trong lên men công nghiệp nhất thiết phải kỵ khí ở 2 - 3 ngμy đầu, từ ngμy thứ t− thổi khí nhẹ hoặc cách 1 giờ cấp khí khoảng 15 phút.
Vi khuẩn Propionibacterium shermanii sinh tr−ởng trong phạm vi pH 4,5 - 7,5 nh−ng vitamin B tích tụ cao nhất ở pH = 6,8 - 7,2 (hình 6.1). Trong quá
trình lên men vi khuẩn phát triển sẽ tạo ra acid propionic lμm pH môi tr−ờng giảm xuống. Một trong những dấu hiệu của quá trình lên men tốt lμ pH môi tr−ờng nuôi cấy giảm rõ rệt trong những ngμy đầu. Vì vậy luôn luôn phải kiểm tra pH môi tr−ờng vμ
điều chỉnh bằng amoniac để giữ pH luôn bằng 7,0.
Môi tr−ờng nhân giống vμ môi tr−ờng lên men về cơ bản giống nhau, tuy nhiên ở
môi tr−ờng lên men l−ợng glucose cần nhiều hơn vμ cần bổ sung tiền chất 5,6 DMB (dimethylbenzylmidazol) với nồng độ 1 - 10 mg/l. Do vi khuẩn có khả năng tạo thμnh hμng loạt chất t−ơng tự vitamin B12 nên cần bổ sung 5,6 DBM lμ base trong nucleotid của vitamin B12, nó có nhiệm vụ chuyển toμn bộ các nhân tố B thμnh vitamin B12 thật vμ hiệu suất sinh tổng hợp cao hơn. Thời gian bổ sung 5,6 DMB có thể bất kỳ nh−ng nếu cho muộn quá nhân tố B ch−a kịp chuyển hết thμnh vitamin B12 sẽ lμm giảm hiệu suất sinh tổng hợp.
Thời gian lên men kéo dμi 6 - 7 ngμy. Ba ngμy đầu nuôi kỵ khí rồi bổ sung 5,6 DMB vμo giờ thứ 72. Nếu cho muộn quá nhân tố B không chuyển hết thμnh vitamin B12 đ−ợc. Trên qui mô 100 m3 hiện nay hiệu suất có thể đạt 80 ữ 100mg/1 lít môi tr−ờng.