- Các Cephalosporin thế hệ
5. Sinh tổng hợp Tetracyclin
5.1. Đại c−ơng
Tetracyclin đ−ợc phát hiện lần đầu vμo năm 1953 bằng ph−ơng pháp khử clo của clotetracyclin. Sau nμy ng−ời ta tìm thấy chủng xạ khuẩn Str. viridifaciens có khả năng sinh tổng hợp ra tetracycline nh−ng thực tế trong sản xuất sử dụng chủng Str. aureofaciens trong điều kiện nuôi cấy đặc biệt (có bổ sung các chất ức chế quá trình Clo hoá).
Tetracyclin base lμ bột kết tinh vμng sẫm, ít tan trong n−ớc vμ dung môi hữu cơ. Dạng base nμy không bền nên thực tế sản xuất tetracyclin clohydrat lμ
bột vμng sáng tan trong n−ớc vừa bền vững, vừa dễ sử dụng.
5.2. Quy trình lên men
Điều kiện vμ đặc điểm của quá trình lên men tạo tetracyclin bởi chủng
Str. aureofaciens gần giống với lên men tạo clotetracyclin. Tuy nhiên điểm khác biệt quan trọng nhất lμ thμnh phần môi tr−ờng nuôi cấy. Dựa vμo thμnh phần môi tr−ờng cung cấp cho xạ khuẩn mμ ng−ời ta có thể định h−ớng đ−ợc sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men.
Str.aureofaciens trong điều kiện nuôi cấy bình th−ờng tạo ra clotetracyclin; nh−ng khi nuôi d−ỡng trong điều kiện đặc biệt có chất ức chế quá trình clo hoá xạ khuẩn sẽ tạo ra chủ yếu tetracyclin. Để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp tetracyclin phải loại những vết Cl– ra khỏi môi tr−ờng. Trong phòng thí nghiệm để loại ion Cl– có thể dùng muối bạc, tuy nhiên ph−ơng pháp nμy không thực tế. Hiện nay ng−ời ta dùng những chất ức chế quá trình clo hoá nh− brom, iod, thiocyanid... Tuy nhiên nếu tăng hμm l−ợng bromid trong môi tr−ờng xạ khuẩn sẽ tổng hợp ra cả 7 – bromtetracyclin vμ ức chế sinh tổng hợp tetracyclin. Vì vậy ngoμi NaBr còn cho thêm các chất ức chế quá trình clo hoá khác nh− 2-mercaptobenzothiazol, 2 - thiouracyl, dẫn chất của acid dithiocarbamic ... Cơ chế tác dụng của các chất nμy ch−a đ−ợc rõ vì chúng không có tác dụng cạnh tranh với ion clo, có thể sự có mặt của nhóm sulfuhydryl (-SH) có tác dụng kích thích phản ứng oxy hoá khử lμm loại Cl ra khỏi phân tử kháng sinh.
Thμnh phần môi tr−ờng lên men (%):
Cao ngô 0,5
NaBr 0,2
Benzylthiocyanid (C6H5CH2-SCN) 0,0001
2-mercaptobenzothiazol 0,001
CaCO3 0,5
Dầu phá bọt theo nhu cầu
pH sau khử trùng 6,8 – 7,2
Nhiệt độ nuôi cấy 28OC
Thời gian lên men 120 giờ – 144 giờ Cung cấp khí vô trùng 0,8 – 1 VVM
5.3. Qui trình chiết xuất tetracyclin
Cũng nh− các kháng sinh khác thuộc nhóm nμy, tetracyclin có thể đ−ợc chiết bằng cả 3 ph−ơng pháp. ở đây giới thiệu ph−ơng pháp chiết bằng dung môi hữu cơ:
Dịch lên men xong, bơm vμo thùng chứa, hạ nhiệt độ xuống 15°C. Thêm acid oxalic vμ hạ pH = 2,5 – 3,0. Thêm Na2CO3 khuấy pH = 3,5. Thêm K4Fe(CN)6 khuấy tiếp 15 phút để loại sắt. Lấy mẫu phân tích Ca++ vμ Fe++: yêu cầu Ca++ ≤ 0,4 - 0,6 g/lít. Fe++ không có. Trong thiết bị chiết thêm hỗn hợp isooctanol có chứa 1,5 - 2,5% acid oleic tỉ lệ dung môi/dung dịch kháng sinh lμ
1 : 3 - 1 : 4, thêm NH4OH 5% vμo vμ khuấy pH = 9 - 9,5. Tetracyclin chuyển sang dung môi, dịch thải chuyển về phân x−ởng thu hồi dung môi. Dịch chiết isooctanol bơm vμo thiết bị chứa cùng với acid oxalic (dung dịch 5%) thêm vμo với l−ợng 0,5 - 0,6% theo tỉ lệ dịch kháng sinh. Tại đây sẽ loại đi Ca++ vμ các kim loại khác dạng oxalat. Ly tâm loại oxalat. Tẩy mμu bằng than hoạt 0,25 - 0,3%. Sau khi lọc loại than trên lọc hút chân không thì kết tinh tetracyclin base bằng dung dịch NH4OH 10%. Khuấy để kết tinh ở nhiệt độ 15°C vμ pH 3,9 - 4,5. Ly tâm thu sản phẩm vμ sấy khô bằng máy sấy tầng sôi. Hiệu suất chiết đạt 70 – 75%.
Trên thực tế, tetracyclin không bền vững, ít hoμ tan trong n−ớc nên khó sử dụng. Vì vậy th−ờng chế tạo dạng muối clohydrat tetracyclin bền vững hơn (có dạng viên nén). Tại bộ môn Công nghiệp D−ợc, Tr−ờng Đại học D−ợc Hμ
Nội lμm nh− sau:
Trong nồi phản ứng có máy khuấy đổ 30 lít butanol vμ 4 kg tetracyclin base vμo khuấy liên tục vμ thêm 0,6 lít acid clohydric đặc. Khuấy đến tan hết, hạ nhiệt độ xuống 5°C giữ 1 giờ - lọc loại tủa nếu có. Nếu để chế tạo tetracyclin clohydrat tiêm phải lọc qua lọc Seizt. Dịch lọc đ−ợc kết tinh trong thiết bị thuỷ tinh hay tráng men khi nâng nhiệt độ lên 40°C. Lọc hoặc ly tâm lấy tinh thể. Rửa tinh thể bằng aceton để loại butanol. Sấy chân không ≤ 40°C.
Hiệu suất chế tạo clohydrat tetracyclin đạt 90%. lọc, ly tâm pH = 2,5 - 3,0 Hạ xuống 15oC lọc acid hóa dịch lên men loại tạp acid oxalic K4FeCN6 tảy mμu, loại tạp Loại Ca, Mg Tảy màu = than hoạt
Chiết
isooctanol chứa a.oleic chỉnh pH 9 - 9,5 NH4OH 10% kết tủa tetracyclin base butanol HCl đặc 40oC tetracyclin HCl lọc sấy tầng sôi kiểm nghiệm
Hình 9.4. Quy trình chiết tetracyclin bằng dung môi hữu cơ