- Các Cephalosporin thế hệ
3. Sinh tổng hợp Gentamicin
3.1. Đại c−ơng
Gentamicin đ−ợc phát hiện lần đầu vμo năm 1963 trong môi tr−ờng nuôi cấy chủng xạ khuẩn Micromonospora purpurea. Cùng với tobramycin (1975) vμ amikacin (1976), gentamicin có thể đ−ợc coi nh− kháng sinh thế hệ 2 của nhóm aminoglycosid. Gentamicin đ−ợc sử dụng rộng rãi nhất trong số các aminoglycosid vì có phổ kháng khuẩn rộng vμ đặc biệt có tác dụng trên các vi khuẩn Gram (-).
3.2. Cấu trúc hoá học vμ tính chất
Gentamicin sulfat lμ một phức hợp sulfat của 3 chất chủ yếu có cấu trúc gần giống nhau đ−ợc gọi lμ gentamicin C1, gentamicin C1a vμ gentamicin C2,
ngoμi ra còn một phần rất nhỏ gentamicin C2a vμ gentamicin C2b. Các chất nμy đều lμ dẫn chất của DOS (2-deoxystreptamin).
Gentamicin có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram (+) vμ Gram (-). Phổ diệt khuẩn chủ yếu trên các vi khuẩn hiếu khí Gram (-) vμ các tụ cầu khuẩn, kể cả các chủng tạo ra penicillinase vμ kháng methicillin.
Gentamicin không hấp thu qua đ−ờng tiêu hoá, đ−ợc sử dụng dạng tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp (th−ờng bμo chế dạng dung dịch tiêm chứa 2; 10 mg/ml vμ 40; 80; 160 mg/2 ml). Gentamicin th−ờng đ−ợc dùng phối hợp với các kháng sinh khác (β-lactam) hoặc cùng với các chất diệt khuẩn khác để mở rộng phổ tác dụng vμ tăng hiệu lực
Bảng 10.3. Cấu trúc hoá học của gentamicin theo D−ợc điển Anh BP 2003
Tên
gentamicin Thành phần % Công thức cấu tạo R1 R2 R3
C1 20 - 35 C21H43N5O7 CH3 NH2CH3 H C1a 10 - 30 C19H39N5O7 H NH2 H C1a 10 - 30 C19H39N5O7 H NH2 H C2 C20H41N5O7 CH3 NH2 H C2a C20H41N5O7 H NH2 CH3 C2b 40 - 60 C20H41N5O7 CH3 NH2 H
3.3. Quy trình lên men sinh tổng hợp
3.3.1. Chủng giống
Gentamicin do một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Micromonospora tạo ra. Trong thực tế chủng M. purpurea var. nigrecens vμ M. echinospora lμ những chủng quan trọng nhất đ−ợc ứng dụng vμo sản xuất công nghiệp.
M. purpurea var. nigrecens lμ chủng vi sinh vật hiếu khí, không hoặc rất
Micromonospora hầu nh− chỉ có khuẩn ty cơ chất phân nhánh, không hình thμnh khuẩn ty khí sinh. Đ−ờng kính khuẩn ty từ 0,4 – 0,8mcm. Khi ch−a tạo bμo tử bề mặt khuẩn lạc có mμu vμng sáng đến mμu da cam hoặc nâu đỏ tuỳ thuộc vμo môi tr−ờng vμ điều kiện nuôi cấy.
3.3.2. Quy trình lên men
Môi tr−ờng giữ giống (%):
Pepton 0,6
Cao nấm men 0,3
Cao thịt 0,15
Casein thuỷ phân 0,4
Glucose 1,0 (NH4)2SO4 0,35 KH2PO4 0,1 MgSO4.7H2O 0,5 Thạch 2% N−ớc máy vđ pH 6,8 – 7,0
Nhiệt độ nuôi cấy 28OC Môi tr−ờng nhân giống (%): Tinh bột khoai tây 1,0 Bột đậu t−ơng 1,0 Saccharose 1,0 CaCO3 0,4 CoCl2.6H2O 0,002 N−ớc máy vđ pH 6,8 – 7,0
Nhiệt độ nuôi cấy 28OC Nhiệt độ nuôi cấy 28OC
Môi tr−ờng lên men (%): Bột ngô 2,5 Bột đậu t−ơng 3,0 Saccharose 1,0 CaCO3 0,4 Alpha amylase 0,001 CoCl2.6H2O 0,002 Dầu phá bọt 0,6 N−ớc máy vđ pH 6,5 – 6,7
Lên men tạo gentamicin đ−ợc thực hiện theo ph−ơng pháp nuôi cấy chìm. Quá trình nμy đ−ợc thực hiện theo các b−ớc cơ bản:
Giống thạch nghiêng đ−ợc hoạt hoá trong môi tr−ờng giữ giống ở 28OC trong 4 -5 ngμy rồi cấy vμo môi tr−ờng nhân giống cấp 1 vμ lắc 200 – 250 v/ph trong khoảng 48 giờ, tiếp tục nhân giống cấp 2 với l−ợng giống cấy truyền 2 - 4% (nếu trong bình nón) vμ tiếp tục nhân giống, l−ợng giống cấy vμo nồi lên men lμ 10 - 15%. Quá trình lên men kéo dμi khoảng 96 – 120 giờ, nhiệt độ thích hợp 26 – 28OC, pH môi tr−ờng 6,8 – 7,2. Cấp khí với l−u l−ợng 1 VVM. Hiệu suất chủng lên men th−ờng không ổn định do sản phẩm lμ một hỗn hợp nhiều loại gentamicin, có thể đạt tới 1500 mcg/ml hoặc cao hơn.
3.3.3. Chiết xuất vμ tinh chế
Dịch lên men đ−ợc acid hoá bằng acid sulfuric 4N đến pH 2,0 – 2,5 để giải phóng các kháng sinh bám vμo khuẩn ty, bổ sung chất trợ lọc, khuấy trộn rồi lọc bằng lọc trống hay lọc ép khung bản lấy dịch lọc. Trung tính hoá dịch lọc bằng dung dịch NaOH 40%, loại ion Ca++ bằngacid oxalic đến pH = 3 – 3,5. Khuấy trộn rồi trung tính hoá lại đến pH = 7,0 – 7,5. Lọc loại tủa. Dịch lọc đã xử lý đ−ợc chiết tách kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion (th−ờng sử dụng Amberlit IRC50 đã đ−ợc hoạt hoá ở dạng R-COO–Na+). Sau khi cột bão hoμ rửa cột bằng n−ớc đã khử ion, phản hấp phụ kháng sinh bằng dung dịch acid sulfuric 4N. Phân đoạn đậm đặc nhất đ−ợc chỉnh về pH = 4,5 bằng trietylamin, tẩy mμu bằng than hoạt. Lọc loại than rồi dùng methanol tủa lấy sản phẩm thô với tỷ lệ dung dịch kháng sinh: methanol lμ 1:8,5. Lọc rửa tủa thô bằng methanol vμ aceton, sấy chân không ở 40OC vμ 30 – 70 mmHg. Sản phẩm thu đ−ợc lμ gentamicin thô ở dạng muối sulfat.
Quá trình tinh chế gentamicin thô đ−ợc tiến hμnh nh− sau: Hoμ
gentamicin sulfat thô vμo n−ớc cất, chỉnh pH = 7,0 -7,5. Tẩy mμu bằng than hoạt (khoảng 5%). Dịch lọc đ−ợc đem sắc ký trao đổi ion với nhựa cationit Amberlit CG50 dạng hoạt hoá NH4. Phản hấp phụ bằng dung dịch NH4OH 0,3N. Lấy phân đoạn đậm đặc nhất. Cô chân không. Tảy mμu bằng than hoạt. Sau khi lọc loại than thì tủa kháng sinh bằng methanol. Rửa tủa bằng aceton. Tinh thể sấy khô trong chân không ở 40OC vμ 30 – 70 mmHg. Sản phẩm thu đ−ợc đem đi kiểm nghiệm vμ đóng gói.
Tự l−ợng giá
1. Kể tên các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh nhóm aminoglycosid. 2. Tìm mối liên hệ giữa cấu trúc của streptomycin với thμnh phần
môi tr−ờng lên men.
3. Nêu quy trình chiết xuất streptomycin từ môi tr−ờng lên men. 4. Nêu tên chủng vi sinh vật sinh gentamicin vμ trình bμy quy trình
Ch−ơng 11