10. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh
11.1.1. Ph−ơng pháp pha loãng liên tục
Dùng để định l−ợng kháng sinh trong dịch nuôi cấy hay trong dịch chiết.
Nguyên tắc: pha loãng kháng sinh trong môi tr−ờng canh thang (trong suốt) trong các ống nghiệm đã tiệt trùng thμnh các nồng độ khác nhau:
1 : 10 ; 1 : 20 ; 1 : 40 ; 1 : 80 ; 1 : 160… hay 1 : 100 ; 1 : 200 ; 1 : 300 ; 1 : 400 1 : 800… hay 1 : 100 ; 1 : 200 ; 1 : 300 ; 1 : 400 1 : 800… hay 1 : 2 ; 1 : 4 ; 1 : 8 ; 1 : 16 ; 1 : 32... Tại mỗi nồng độ kháng sinh trong các ống nghiệm đó, cho vμo một l−ợng xác định vi sinh vật kiểm định. Đặt các ống nghiệm vμo tủ ấm 37°C/20 - 24 giờ đem ra đọc kết quả. Nếu ống nμo trong suốt tức lμ tại nồng độ pha loãng đó kháng sinh đã giết chết vi sinh vật kiểm định.
Ví dụ: định l−ợng Streptomycin trong môi tr−ờng nuôi cấy Str. griseus.
Dung dịch streptomycin chuẩn 10mcg/ml. Tiến hμnh theo bảng sau:
Số ống nghiệm Kháng sinh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Độ pha loãng 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:28 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 Streptomycin chuẩn 10 μg/ml - - - - - + + + + + + + Streptomycin thử - - - - - - - - - + + +
Chú thích: dấu (-) vi khuẩn bị giết chết dấu (+) vi khuẩn phát triển
ở ống nghiệm số 5 (độ pha loãng 1:32) của kháng sinh chuẩn vi khuẩn kiểm định không phát triển đ−ợc.
Vμ ống số 10 (độ pha loãng 1:1024) của dịch kháng sinh cần định l−ợng vi khuẩn kiểm định không phát triển đ−ợc. Có thể tính toán nồng độ kháng sinh theo công thức sau:
o X Dc Dt X = ì trong đó:
Dc: độ pha loãng của kháng sinh chuẩn Dt: độ pha loãng của kháng sinh thử X: nồng độ kháng sinh cần định l−ợng Xo: nồng độ ban đầu của kháng sinh chuẩn trong thí nghiệm trên ta có:
ml mcg X 10 320 / 32 1024ì = =
Để kết quả đ−ợc chính xác khi định l−ợng kháng sinh bằng ph−ơng pháp pha loãng cần chú ý những điểm sau:
(1) Dùng môi tr−ờng để pha loãng có thμnh phần ổn định (2) Thao tác phải tuyệt đối vô trùng
(3) L−ợng vi khuẩn kiểm định cho vμo các ống nghiệm phải bằng nhau. (4) Thời gian ủ để cho vi sinh vật kiểm định phát triển phải hằng định. Có thể pha loãng kháng sinh cần thử vμo môi tr−ờng thạch - canh thang sau đó đổ ra hộp petri đợi thạch đông ta cấy các vi sinh vật kiểm định vμo, để tủ ấm cho vi sinh vật phát triển sau 20 - 24 giờ mang ra đọc kết quả. Ưu điểm của ph−ơng pháp nμy lμ trên 1 hộp Petri ta có thể thử nhiều vi sinh vật kiểm định.