- Các Cephalosporin thế hệ
3. Sinh tổng hợp các Tetracyclin tự nhiên
Có gần 10 tetracyclin tự nhiên nh−ng thực tế ng−ời ta chỉ sản xuất ở quy mô công nghiệp 4 sản phẩm lμ clotetracyclin, tetracyclin, oxytetracyclin vμ
demeclocyclin.
3.1. Chủng giống
Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh nhóm tetracyclin tập trung chủ yếu ở xạ khuẩn. Các giống xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin gồm những chủng Streptomyces rimosus; Str.aureofaciens; Str. platensis; Str. gilvus… Cơ chế sinh tổng hợp các tetracyclin rất phức tạp với sự chuyển hoá qua nhiều giai đoạn trung gian khác nhau (cơ chế sinh tổng hợp clotetracyclin gồm 72 phản ứng). Quá trình sinh tổng hợp nμy có thể chia lμm 3 giai đoạn chính:
− Sinh tổng hợp chuỗi oligoketidamit mạch thẳng từ các nguồn hydratcarbon.
− Khép vòng chuỗi oligoketidamit tạo thμnh bộ khung pretetramit (hoặc 6- metylpretetramit).
− Chuyển hoá tiếp pretetramit (hoặc 6- metylpretetramit) để tạo các tetracyclin. OH OH OH OH CH3 OH CONH2 OH OH OH OH CH3 OH CONH2 OH OH OH O O CH3 OH CONH2 O HO OH OH O O CH3 OH CONH2 HO NH2 OH OH O O CH3 OH CONH2 HO N CH3 H3C OH O O O CH3 OH CONH2 HO N CH3 H3C HO OH O O CH3 OH CONH2 HO N CH3 H3C HO OH (A) (B) (D) (C) Tetracyclin (E) (F)
Hình 9.1. Cơ chế sinh tổng hợp tetracyclin từ pretenamid (A)
OH OH O O CH3 OH CONH2 HO N CH3 H3C OH OH O O CH3 OH CONH2 HO N CH3 H3C OH OH O OH O OH OH CONH2 HO N CH3 H3C OH H3C (E) Pretenamid (A) Oxytetracyclin
3.2. Đặc điểm quá trình lên men
Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin lμ những chủng vi sinh vật hiếu khí nên quá trình nuôi cấy cần lắc hoặc khuấy trộn kèm theo sục khí với l−u l−ợng khoảng 1VVM. Việc đảm bảo thông khí hợp lý vμ liên tục trong suốt quá trình lên men có ảnh h−ởng rất lớn đến hiệu suất sinh kháng sinh, đặc biệt lμ trong 6 – 12 giờ đầu tiên (quá trình có thể bị huỷ hoμn toμn nếu ngừng cấp oxy chỉ trong 5 phút). pH tối −u cho sự phát triển lμ 6,6 – 7,2. Mỗi bμo tử nảy 2-4 chồi tạo thμnh hệ sợi. Kháng sinh nằm trong sinh khối xạ khuẩn. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp từ 27 – 28OC. Thời gian lên men th−ờng khoảng 110 – 140 giờ.
3.3. Nhu cầu dinh d−ỡng
Nguồn hydrat carbon chủ yếu lμ bột ngô, bột mì, tinh bột khoai tây hoặc tinh bột ngô. Ngoμi ra ng−ời ta còn bổ sung vμo môi tr−ờng nuôi cấy một số loại đ−ờng nh− glucose (thích hợp với S. rimosus) hoặc maltose (thích hợp với
S. aureofaciens). Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin không có khả năng phân giải saccharose vμ lactose.
Nguồn nitơ: Môi tr−ờng sản xuất cần có cả nguồn nitơ vô cơ nh−
(NH4)2SO4 cũng nh− Nitơ hữu cơ (cao ngô, bột đậu t−ơng, bột lạc...).
Nguồn phospho: Đối với quá trình sinh tổng hợp các tetracyclin hμm l−ợng phospho vô cơ hoμ tan trong môi tr−ờng lên men (chủ yếu từ cao ngô) có ý nghĩa rất quan trọng đến hiệu suất tạo kháng sinh: thiếu phospho giống phát triển kém vμ hiệu suất lên men thấp, thừa phospho giống phát triển nhanh nh−ng hoạt lực kháng sinh giảm đáng kể do sự tích tụ acid acetic vμ acid pyruvic trong môi tr−ờng. Để tránh thừa phospho ng−ời ta bổ sung CaCO3 để tạo thμnh các phosphat calci không tan. Ngoμi ra nó còn có tác dụng giảm nồng độ các kháng sinh hoμ tan để tránh độc tính của kháng sinh đối với giống.
Nguồn kim loại vi l−ợng: Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin cũng cần một số kim loại nh− Mg, Mn, Fe, Cu… vμ th−ờng đ−ợc bổ sung d−ới dạng muối sulfat. Nếu môi tr−ờng có cao ngô, bột đậu, bột lạc… thì không cần bổ sung vì bản thân các loại nguyên liệu nμy đã sẵn có các muối kim loại. Cần chú ý đặc biệt đến hμm l−ợng sắt vì nếu sắt thừa sẽ kết hợp với Tetracyclin tạo ra những phức chất không có hoạt tính kháng sinh.
ở pha phát triển thứ nhất trong điều kiện lên men chìm, các chủng xạ khuẩn nμy sinh tr−ởng mạnh trong khoảng từ 24 – 48 giờ vμ khối l−ợng khuẩn ty đã đạt tới 70 – 80% mức tối đa, l−ợng chất dinh d−ỡng tiêu thụ từ 60 – 80%. B−ớc sang pha lên men thứ hai quá trình phát triển chậm lại nên tốc độ tiêu thụ chất dinh d−ỡng giảm đi rất nhiều, sự tăng sinh khối (l−ợng khuẩn ty) chậm lại dần đạt tới mức độ cực đại rồi ổn định vμ xạ khuẩn b−ớc sang giai đoạn tự phân. Trong giai đoạn nμy l−ợng chất dinh d−ỡng trong môi tr−ờng còn lại rất ít vμ hầu nh− không đ−ợc sử dụng.
Sự tổng hợp kháng sinh: Nghiên cứu động thái của quá trình lên men cho thấy các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin bắt đầu pha thứ hai ở khoảng thời gian 25 - 35 giờ; sinh khối đạt mức cao nhất ở 45 - 50 giờ (đối
với Str. aureofaciens) vμ ở 48 - 55 giờ (đối với Str.rimosus lμ chủng phát triển chậm hơn). L−ợng kháng sinh đạt tối đa ở 120 -144 giờ. Hiệu suất sinh tổng hợp lên tới 20.000 mcg/ml môi tr−ờng lên men với những chủng siêu tổng hợp.
3.4. Nguyên tắc chiết xuất kháng sinh từ môi tr−ờng lên men
Các kháng sinh nhóm tetracyclin có tính chất l−ỡng tính nên có thể dùng cả 3 ph−ơng pháp sau để chiết tách sản phẩm ra khỏi dịch lên men:
− Chiết bằng dung môi hữu cơ có chất mang − Chiết bằng ph−ơng pháp kết tủa
− Chiết bằng ph−ơng pháp trao đổi ion
Tuỳ theo loại kháng sinh cụ thể, độ tinh khiết cần thiết của sản phẩm mμ ng−ời ta lựa chọn ph−ơng pháp thích hợp. D−ới đây mô tả quy trình sinh tổng hợp vμ chiết xuất một số kháng sinh cụ thể của nhóm tetracyclin.