4.1. Các nhân tốlàm rắn môi trường
Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel được sử dụng phổ biến để chuẩn bị cá c môi trường nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid). Trong nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trường và chết do thiếu oxy, môi trường ở trạng thái lỏng này thích hợp cho việc nuôi cấy protoplas, huyền phù tế bào, nuôi cấy thể phôi. Khi sử dụng môi trường lỏng để nuôi cấy thì dung dịch phải được lắc hoặc khuấy.
Môi trường ở trạng thái gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh (static conditions), với các mục đích phát sinh callus, phân hóa và phát sinh cơ quan hình thái. Những thuận lợi trong việc sử dụng môi trường dạng gel là:
- Dễ quan sát các mô nuôi cấy
- Tính định hướng của các mô nuôi cấy được lưu giữ
- Mô nuôi cấy được đặt trên bề mặt môi trường nên không cần các biện pháp thông khí
- Chồi và rễ phát triển ổn định. So với mô nuôi cấy trong môi trường lỏng chồi và rễ có thể bị mất phương hướng
- Trong môi trường lỏng lắc callus có thể bị vỡ hoặc tạo thành các tế bào đơn. Tuy nhiên, môi trường dạng gel có nhiều bất lợi: các chất độc tiết ra từ mô nuôi cấy không được khuếch tán nhanh, tình trạng thông khí kém sẽ tác động đến sự phát triển và chức năng của rễ.
Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏ - Rhodophyta), chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác . Trước tiên, gel của agar không phản ứng với các thành phần của môi trường . Thứ hai, chúng không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành. Bình thường, từ 0,5-1% agar được dùng trong môi trường để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật . Trong những nghiên cứu về dinh dưỡng , việc sử dụng agar được tránh bởi vì ag ar thương phẩm không sạch do có chứa một số ion Ca , Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết. Tuy nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể được loại bỏ bằng cách rửa agar với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60o
C trong 24 giờ. Nói chung, ở 80oC agar ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 40oC trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar cao từ 6-12 g/L nước.
Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế sử dụng bởi vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25oC). Các hợp chất khác đã được thử nghiệm thành công bao gồm methacel , alginate, phytagel và gel -rite. Công ty FMC Corp. gần đây đã phát triển một l oại agarose được tinh sạch cao gọi là Sea Plaque (k),
loại này có thể được dùng để phục hồi các protoplast đơn (single protoplast) trong nuôi cấy. Cellophane đục lỗ (perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper bridge ), bấc giấy lọc (filter paper wick ), bọt polyurethane (polyurethane foam ) và xốp polyester (polyester fleece ) là các phương thức thay đổi giá thể được dùng trong môi trường nuôi cấy mô hoặc tế bào.
Điều thuận lợi khi làm việc với các hợp chấ t tạo gel nhân tạo là chúng tạo ra các gel sạch ở các nồng độ tương đối thấp (1,25-2,5 g/L) và nó có thể giúp phát hiện sự nhiễm bẩn được phát triển trong suốt thời gian nuôi cấy . Các mẫu vật sinh trưởng tốt hơn trên agar hoặc các tác nhân tạo giá thể khác phụ thuộc vào loại mô và từng loài khác nhau.
4.2. pH môi trường
Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường , pH có t hể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm . Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH 5,0-6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu. Độ pH cao hơn sẽ làm ch o môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar. Hầu hết các môi trường nuôi cấy nghèo đệm , vì thế chúng làm dao động giá
trị pH, sự giao động này có thể gây bất lợi cho thí nghiệm nuôi cấy dài ngày và sự sinh trưởng của các tế bào đơn hoặc các quần thể tế bào ở mật độ thấp.
Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào . Vì vậy, đối với từng môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu . Nuôi cấy callus của nhiều loài cây , pH ban đầu thường là 5,5- 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt đ ược giá trị từ 6,0-6,5. Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như acid amin, vitamin thì nhất định phải phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5-6,5.
Những thí nghiệm nu ôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc.