6.1. Các vấn đề nảy sinh trong quá trình hình thành thểđơn bội
Có nhiều vấn đề liên quan đến việc cảm ứng tạo thể đơn bội và tỷ lệ phần trăm túi phấn có thể hình thành phôi đơn bội có thể sống được rất thấp ở nhiều loại cây. Nhiều yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến quá trình này.
Những yếu tố quan trọng nhất là:
- Thường không có sự tăng trưởng và phát triển xảy ra in vitro hoặc sự tăng trưởng được khởi sự rồi sau đó phôi bị chết non.
- Thể nhị bội và tứ bội thường được tái sinh cùng lúc với thể đơn bội.
- Sự tái sinh của những thể nhị bội có thể lấn át bởi sự tái sinh của hạt phấn phân lập. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng được với một số loài giới hạn.
- Sự phân chia của tế bào chọn lọc phải xảy ra trong các tiểu bào tử đơn bội và không xảy ra ở những mô nhị bội không mong muốn.
Sự phân chia của các tế bào chọn lọc thường không xảy ra được.
- Sự tái sinh của thể bạch tạng thường khó tránh khỏi ở các loài ngũ cốc.
- Sự cảm ứng tạo thể đơn bội in vitro thường không đảm bảo về mặt kinh tế do tỷ lệ thành công thấp.
- Sự hình thành callus cho dù tự nhiên hay do ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thường có ảnh hưởng không tốt.
- Có một số cải tiến nhỏ trong việc cô lập một thể đơn bội từ một hỗn hợp gồm các cá thể đơn bội và các cá thể có mức độ bội thể cao hơn, bởi vì trong trường hợp này các cá thể đơn bội dễ dàng tăng trưởng mạnh hơn các thể bội khác.
- Sự chọn lọc cá thể đơn bội và sự tạo ra các thể đồng hợp tử từ các cá thể này bị tác động bởi yếu tố thời gian vì việc nghiên cứu về di truyền tế bào là cần thiết.
Đôi khi sự chọn lọc có thể thực hiện được nhờ các dấu hiệu đánh dấu về mặt di truyền.
- Sự nhân đôi nhiễm sắc thể của thể đơn bội không phải luôn luôn tạo ra thể đồng tử. Các thể nhị bội đồng hợp tử đôi khi có sự xuất hiện những khác biệt trong các thể hệ của nó.
6.2. Những vấn đề cụ thể
Việc kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội là một đóng góp rất lớn cho công tác cải thiện giống cây trồng.
Nuôi cấy bao phấn hiện nay vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu to lớn của công tác giống cây trồng, vì rằng kỹ thuật này mới thành công ở khoảng trên 30 loài của trên 20 chi, chủ yếu ở các chi và loài thuộc họ cà (Solanaceae).
Thời gian qua, người ta đã tiến hành các thí nghiệm với qui mô lớn trên các đối tượng cây trồng ngũ cốc thuộc họ hòa thảo (Poaceae), nhưng kết quả mới hạn chế ở lúa mì và lúa nước.
Muốn ứng dụng phương pháp đơn bội có hiệu quả đòi hỏi phải có số lượng đơn bội lớn. Nhưng đến nay có thể nói chúng ta chưa nắm được chín h xác yêu cầu dinh dưỡng cần thiết trong môi trường nuôi cấy.
Đối với thuốc lá , môi trường dinh dưỡng để nuôi bao phấn rất đơn giản gồm muối khoáng và sucrose , không cần các chất hữu cơ khác cũng như hormone sinh trưởng.
Thế nhưng để nuôi cấy bao phấn lúa nước và lúa mì thành công các tác giả Trung Quốc phải dùng thêm dịch chiết khoai tây mà thành phần chưa được biết tới.
Mặc dù vậy, bao phấn các loài ngũ cốc được nuôi cấy cũng chỉ tạo cal lus, để có cây hoàn chỉnh phải tiến hành tạo chồi từ callus đó. Và thông thường thì tỷ lệ bạch tạng rất cao , chẳng hạn: Mix và cs (1977) nhận được 3.400 cây bạch tạng trong số 4.000 cây yến mạch tái sinh từ callus bao phấn.
Ngoài ra, trong số cá thể thu được thông qua bước tái sinh từ callus một tỷ lệ đáng kể đã là cây nhị bội (~ 60%).
Trong nuôi cấy bao phấn , việc xuất hiện những phôi lưỡng bội từ tế bào lưỡng bội của vỏ bao phấn chưa thể loại trừ được. Vì vậy, người ta đang thí nghiệm tạo cây đơn bội từ hạt phấn phân lập. Đương nhiên môi trường nuôi cấy hạt phấn phân lập đòi hỏi phức tạp hơn môi trường dinh dưỡng nuôi cấy bao phấn . Môi trường nuôi hạt phấn
Petunia có chứa auxin, cytokinin và boric acid.
Thường là người ta phải nuôi cả bao phấn 4-16 ngày trên một môi trường dinh dưỡng rồi sau đó mới tách riêng hạt phấn để nuôi tiếp tục trên môi trường cũ đó . Hiệu quả của phương pháp này rất cao, đã đạt tới 1.000 phôi/ đĩa petri.
Thông qua quá trình nuôi trước đó , môi trường dinh dưỡng được bổ sung thêm những chất cần thiết do bao phấn tiết ra . Glutamine là một thành phần quan trọng , nhưng còn nhiều chất khác vẫn chưa được biết tới.