3. NUÔI CẤY PHÔI HỮU TÍNH
3.3. Môi trường dinh dưỡng
Nhu cầu dinh dưỡng của phôi trong quá trình phát triển in vivo chia làm hai
nhũ và (b) pha tự dưỡng (autotrophic phase)-pha muộn, ở pha này phôi có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho sinh trưởng của chúng . Giai đoạn phôi chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng khác nhau tùy loài.
Thành phần môi trường cho sinh trưởng của phô i non hoặc chưa trưởng thành khác với phôi trưởng thành. Monnier (1976), đã xây dựng phương pháp cho phép phát triển hoàn chỉnh phôi non ở Capsella (giai đoạn hình cầu sớm ) cho đến khi nảy mầm mà không cần chuyển chúng khỏi vị trí nuôi cấy đầu tiên trong đĩa petri (Hình 4.2). Theo hướng này, Ko và cs (1983) cũng thu được sự sinh trưởng liên tục của các phôi chưa trưởng thành ở lúa.
Hình 4.2. Phương pháp nuôi cấy phôi non cho đến khi nảy mầm mà không cần chuyển chúng khỏi vị trí nuôi cấy đầu tiên trong đĩa petri.
3.3.1. Muối khoáng
Các chất dinh dưỡng của môi trường MS , B5 và White có cải biến nhất định được sử dụng cho hầu hết các thí nghiệm n uôi cấy phôi. Chẳng hạn, môi trường nuôi cấy phôi của Capsella có nồng độ potassium cao hơn (bổ sung 350 mg/L KCl) và nồng độ calcium (CaCl2) gấp đôi, nồng độ của NH 4NO3 và Fe -EDTA giảm gần một nửa , còn nồng các muối vi lượng theo MS là gấp đôi.
3.3.2. Nguồn carbon
Saccharose là nguồn carbon chủ yếu được sử dụng để cung cấp năng lượng cho phôi nuôi cấy in vitro. Trong nuôi cấy phôi của một số loài (ví dụ: ngô) có thể cần bổ sung maltose, lactose, raffinose, hoặc mannitol.
Một số loài thuộc họ Rosaceae và các loài lai thuộc chi Lilium bổ sung glucose tỏ ra có ưu thế hơn saccharose. Phôi của Heracleum spondylum sinh trưởng hiệu quả trên môi trường chứa glucose , fructose, galactose, mannose, hoặc mannitol. Glucose cũng cần thiết cho sinh trưởng của rễ ở phôi Ginkgo trưởng thành.
Glucose và saccharose ngoài vai trò dinh dưỡng , còn có khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường (phải lưu ý đến tuổi phôi ). Phôi trưởng thành sinh trưởng khá tốt ở nồng độ saccharose thấp nhưng các phôi non hơn thường đòi hỏi nồng độ của carbonhydrate cao hơn. Nói chung, các nồng độ khác nhau của saccharose dùng trong nuôi cấy phôi phụ thuộc vào loài và kích thước/tuổi của phôi.
3.3.3. Nguồn nitrogen
Phôi có một hệ thống enzyme rất tốt có thể biến đổi nitrite thành nitrate và sau đó thành ammonium . Ammonium nitrate có ưu thế quan trọng hơn so với KNO 3,
NaNO3 và (NH4)2HPO4. Sự có mặt của ion NH4
+ rất cần thiết cho sinh trưởng và phân hóa của phôi.
Các amino acid khác nhau và các amide của chúng đã được thử nghiệm cho nuôi cấy phôi.
Một số tác giả cho rằng asparagine tăng khả năng sinh trưởng của phôi , nhưng những tác giả khác lại thấy glutamine là nguồn nitrogen có ưu thế sinh trưởng cho phôi của một số loài (ví dụ: Capsella bursa-pastoris, Arabidopsis thaliana, Reseda odorata) còn asparagine lại ức chế mạnh sự sinh trưởng của chúng . Các amino acid khác có tác dụng kích thích hoặc ức chế.
Dịch thủy phân casein (CH), một phức hợp amino acid , được sử dụng rộng rãi để bổ sung vào các môi trường nuôi cấy phôi . Nồng độ CH tối ưu cho Hoderum vulgare khoảng 500 mg/L, trong khi phôi Datura tatula sinh trưởng ở nồng độ CH 50 mg/L. Các amino acid, CH và các amide có thể được khử trùng bằng nồi khử trùng áp suất hơi và cùng với các chất dinh dưỡng của môi trường.
3.3.4. Dịch chiết thực vật tự nhiên
Nếu môi trường được bổ sung thêm nước dừa không khử trùng bằng autoclave , các phôi này sẽ tăng chiều dài nhưng không có dấu hiệu nảy mầm sớm . Nhiều tác giả gợi ý rằng sự có mặt của “nhân tố phôi” (embryo factor) trong nội nhũ dạng lỏng của nước dừa có thể thay thế cho sự thiếu hụt đường, amino acid, các hormone sinh trưởng và các chất khác trong môi trường nuôi cấy . Nước dừa có hiệu quả kích thích sinh trưởng của phôi non tách rời của mía đường, lúa mạch, cà chua, cà rốt và các loài dương xỉ.
Các dịch chiết tự nhiên từ các phần của mô ở các loài thực vật có thể kích thích sinh trưởng phôi và ức chế nảy mầm sớm của phôi lúa mạch chưa trưởng thành bằn g cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy dịch chiết chuối , dịch chiết quả chà là , dịch thủy phân lúa mì-gluten và dịch chiết cà chua. Các dịch chiết này có hiệu quả tương tự nước dừa. Dịch chiết của Datura và Sechium cũng có hiệu quả như nước dừa , nhưng dịch chiết từ hạt Lupinus lại có hiệu quả gấp đôi.
Người ta đã cố gắng thay thế các “nhân tố phôi” của nước dừa bằng các hóa chất xác định . Để kích thích sự sinh trưởng của tiền phôi lúa mạch, nước dừa có thể được thay thế bằng môi trường White giàu phosphate bổ sung thêm hai amino acid chính là glutamine và alanine và năm amino acid khác có vai trò như là nguồn cung cấp nitrogen, ở pH 4,5.
Tỷ lệ sống sót của phôi tăng lên khi nồng độ của KCl , KNO3và các thành phần hữu cơ nhất định tăng lên từ 5-10 lần.
3.3.5. Các chất điều khiển sinh trưởng
Auxin và cytokinin không được sử dụng nhiều trong nuôi cấy phôi do chúng cảm ứng tạo callus . Ở nồng độ rất thấp (0,01 mg/L) GA kích thích phát sinh phôi của phôi non lúa mạch mà không cần cảm ứng nảy mầm sớm , và kích thích sinh trưởng ở các phôi tách rời dạng hình tim của Phaseolus. Cũng có một số kết quả cho rằn g ABA có hiệu quả tương tự trên phôi lúa mạch và Phaseolus.
3.3.6. pH môi trường
Các phôi tách rời sinh trưởng tốt trên môi trường có pH 5,0-7,5. Đây là phạm vi pH của dịch noãn (6,0). Nói chung pH môi trường được điều chỉnh 0,5 đơn vị cao hơn giá trị pH mong muốn để bù đắp cho sự thay đổi không thể điều chỉnh trong quá trình khử trùng.
3.3.7. Điều kiện nuôi cấy
Nói chung nhiệt độ 25 ± 2oC thích hợp cho sinh trưởn g và nảy mầm của phôi . Đôi khi nhiệt độ tối ưu cho nuôi cấy phôi có thể khác nhau giữa các genotype trong cùng một loài. Các loài Zamia, Phaseolus, bông thích hợp với nhiệt độ ấm (27-30o
C), trong khi nhiệt độ nuôi cấy phôi của các loài lai ở Brassica, lúa, lúa mạch thích hợp từ 17-22oC.
Trước đây, nhiều tác giả cho rằng ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng của phôi in vitro, nhưng những nghiên cứu gần đây khi nuôi cấy phôi chưa trưởng thành của lúa mạch , lanh, loài lai Aegilops × Hordeum, và các cá thể lai khác loài của Allium lại tiến hành trong tối trước khi chuyển chúng sang điều kiện sáng để nảy mầm. Các phôi sơ cấp dạng hình tim của các loài Ilex mẫn cảm với ánh sáng. Các phôi thứ cấp rất kh ó sinh trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng trong suốt 4 ngày nuôi đầu tiên. Nhiều tác giả cho rằng nuôi trong tối ở giai đoạn ban đầu (bốn ngày) là rất cần thiết theo đó chúng có thể sinh trưởng tới giai đoạn trưởng thành thậm chí dưới điều kiện chiếu sáng liên tục.