7.1. Cảm ứng
a. Tạo cây đơn bội
Nụ hoa được xử lý bằng ly tâm 2.000 vòng/phút trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 5-10oC sau khi cắt để 48 giờ ở 2-5o
C.
b. Tạo cây nhị bội
Nụ hoa được ngâm trong dung dịch colchicine 0,04% và dimethyl sulfoxide (chất dẫn nạp) 2% trong thời gian 24 giờ ở 2-5o
Sau đó rửa sạch dung dịch colchicine và xử lý lạnh tiếp 24 giờ.
7.2. Nuôi bao phấn
Bao phấn được tách từ nụ, nuôi 3 ngày trong môi trường khoáng Halperin chứa đường sucrose 2% và Fe -EDTA (5mL/L: Na2EDTA 754mg + FeSO4.7H2O 557 mg pha trong 100 mL nước sôi), pH 5,8. Nuôi 50 bao phấn trong 5 mL môi trường lỏng.
7.3. Tách và nuôi hạt phấn
Ép bao phấn bằng đũa thủy tinh , lọc hạt phấn bằng lưới có mắt (Φ = 48 µm) và đưa vào ống ly tâm vô trùng có bông ở đáy . Ly tâm 850 vòng/phút và rửa hai lần bằng môi trường mới . Nuôi hạt phấn với nồng độ 104 hạt phấn/mL, mỗi đĩa petri đường kính 5 cm nuôi 2,5 mL dung dịch, dán giấy parafilm và để ở nơi có ánh sáng nhạt . Sau 30 ngày sẽ xuất hiện phôi non.
TÓM TẮT CHƯƠNG
Cây đơn bội (n) có ưu điểm là: kiểu gen biểu hiện chính xác kiểu hình. Các nhà di truyền và chọn giống cây trồng đã chọn thể đơn bội để nghiên cứu di truyền các tính trạng. Các thể đơn bội thông qua đa bội hóa để thu các thể đồng hợp tử. Trong thể đồng hợp tử tất cả gen lặn đều được biểu hiện ra kiểu hình
Có hai phương pháp tạo thể đơn bội in vitro: nuôi cấy bao phấn, hạt phấn; nuôi cấy noãn chưa thụ tinh. Phương pháp nuôi cấy bao phấn được sử dụng phổ biến vì kết quả đem lại cao hơn các phương pháp khác. Trong quá trình nuôi cấy bao phấn chú ý các nhân tố sau: kiểu gen của cây cho bao phấn, nhân tố thành bao phấn, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ và ánh sáng, trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn.
Ứng dụng của thể đơn bội: nghiên cứu về phôi học thực nghiệm, nghiên cứu về tế bào học, nghiên cứu đột biến và di truyền, cải thiện giống cây trồng.
CÂU HỎI
Câu 1: Ý nghĩa của cây đơn bội in vitro?
Câu 2: Phân tích những thuận lợi và khó khăn khi nuôi cấy hạt phấn in vitro?
Câu 3: Hãy so sánh nuôi cấy bao phấn in vitro và nuôi cấy hạt phấn in vitro?
Chương 6. PROTOPLAST THỰC VẬT 1. GIỚI THIỆU VỀ PROTOPLAST
Đặc trưng của tế bào thực vật là có thành cellulose bao quanh (cell wall), sau đó đến màng nguyên sinh (membrane). Thành cellulose giữ cho tế bào thực vật có hình dáng nhất định, còn các hợp chất pectin nằm trong thành có nhiệm vụ liên kết gắn các tế bào với nhau thành mô (tissue).
Vật chất chính bên trong màng nguyên sinh là thông tin di truyền chứa trong nhân của tế bào, quyết định quá trình thực hiện tính toàn năng của tế bào, mọi hoạt động sống của tế bào được diễn ra bên trong lớp vỏ này.
Hình 6.1. Protoplast
Protoplast là tế bào được tách bỏ thành tế bào. Lúc này, nguyên sinh chất và các bào quan chỉ được bao bọc bởi màng nguyên sinh chất. Tế bào trần có 2 đặc điểm quan trọng:
- Màng nguyên sinh cho phép protoplast có thể hấp thu vào tế bào các đại phân tử (nucleic acid, protein) thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp , ty thể, nhân bào theo cơ chế của amip. Nếu để các protoplast cạnh nhau, chúng có thể dễ hòa làm một, đó là hiện tượng dung hợp (fusion) hay còn gọi là lai (hybridization) tế bào.
- Khi nuôi cấy trong môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh thành (vách) tế bào. Đây là đặc tính hết sức đặc biệt của protoplast. Nhờ đó protoplast mới phục hồi được toàn bộ chức năng của một tế bào nguyên thủy.
Khi protoplast tái tạo được thành tế bào, chúng có khả năng phát triển và phân chia hoàn toàn giống những tế bào bình thường.
2. PHÂN LẬP PROTOPLAST
2.1. Các phương pháp phân lập protoplast
2.1.1. Phương pháp cơ học (không dùng các enzyme)
Phương pháp này được đề xuất và sử dụng từ năm 1982 (Nguyễn Quang Thạch, 2009).
Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắt nhọn (sharp-edged knife) và giải phóng các protoplast riêng rẽ , bao gồm các bước sau:
- Gây co nguyên sinh làm khối nguyên sinh chất tách khỏi thành tế bào
- Dùng dao cắt khối mô đã được gây co nguyên sinh, lúc này các khối nguyên sinh chất dưới tác động cơ giới có thể tách rời khỏi thành tế bào, giải phóng ra ngoài dung dịch chiết tách.
Phương pháp này thích hợp để tách protoplast từ các tế bào có không bào của các mô dự trữ như chồi hành và vảy hành (bulbs and scales) của các loài thân hành, rễ củ cải (radish root), vỏ quả giữa của dưa chuột (mesocarp of cucumber ), và rễ củ cải đường (beet root).
Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất phân lập protoplast thấp và không thích hợp để tách protoplast từ mô phân sinh cũng như những tế bào không có không bào, và hiện nay phương pháp này gần như không được sử dụng.
2.1.2. Phương pháp sử dụng enzyme
Ngày nay phương pháp phân lập protoplast chủ yếu là phương pháp sử dụng enzyme. Phương pháp này cho phép phân lập được protoplast từ nhiều nguồn thực vật khác nhau trừ những tế bào đã bị hóa gỗ.
Protoplast được phân lập từ phương pháp này ít bị biến dạng, có sức sống cao, có khả năng phân chia và tái sinh cao.
Phương pháp sử dụng enzyme được bắt nguồn từ kết quả nghiên cứu của Cocking (1960) đã tìm được các enzyme phân giải thành tế bào và thu được protoplast. Phương pháp dùng enzyme có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp cơ học , phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast.
Để phá vỡ thành tế bào, người ta thường dùng các loại enzyme chiết xuất từ các sinh vật chứa nhiều enzyme phân giải thành tế bào như: nấm, ốc và mối.
Trong các chế phẩm enzyme này đều có chứa enzyme cellulase, là loại enzyme tham gia phân cắt cellulose có rất nhiều ở thành tế bào mà không ảnh hưởng đến màng tế bào và các thành phần khác có trong tế bào thực vật.
Ngoài enzyme cellulase ra, trong các chế phẩm enzyme còn chứa nhiều loại enzyme khác như hemicellulase, pectinase, lignase. Các enzyme này có thể được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với nhau.
Bảng 6.1. Các enzyme thương phẩm thích hợp cho phân lập protoplast
STT Enzyme Nguồn thu nhận
1 Các enzyme cellulase Cellulase Onozuka R-10 Cellulase Onozuka RS Cellulase YC Cellulase CEL Cellulysin Meicelase P-1 Driselase Trichodema viride T. viride T. viride T. viride T. viride T. viride Irpex lacteus
STT Enzyme Nguồn thu nhận 2 Các enzyme Hemicellulase Helicase Hemicellulase Hemicellulase H-2125 Rhozyme HP 150 Helix pomatia Aspergillus niger Rhizopus sp. Aspergillus niger 3 Các enzyme Pectinase Macerase Macerozyme R-10 PATE Pectinol Pectolyase Y-23 Zymolyase Rhizopus arrhizus R. arrhizus Bacillus polymyxa Aspergillus sp. Aspergillus japonicus Arthrobacter luteus
Hình 6.2. Phân lập protoplasts của Echinacea purpurea a. Phương pháp trực tiếp (sử dụng enzyme đồng thời)
Phương pháp này sử dụng dung dịch hỗn hợp enzyme chứa đồng thời:
pectinase làm nhiệm vụ phân giải pectin - là chất gắn kết các tế bào trong mô,
hemicellulase phân giải hemicellulose và cellulose phân giải cellulose của thành tế bào.
Thông thường hỗn hợp enzyme chứa 0,5% pectinase và 2% cellulase và hemicellulase trong dung dịch có nồng độ đường cao (11-13% saccharose) hoặc các chất gây thẩm thấu cao (hoặc 13% manitol hay sorbitol).
pH của dung dịch enzyme 5,4 – 5,8.
b. phương pháp gián tiếp(sử dụng enzyme theo trình tự)
Phương pháp này khác với phương pháp trực tiếp ở chỗ quá trình phân lập protoplast được thực hiện từng bước với từng enzyme riêng biệt.
Đầu tiên sử dụng pectinase để tách tế bào trong mô thành các tế bào riêng lẻ, sau đó sử dụng enzyme cellulase và hemicellulase để phân lập protoplast.
Ngày nay thường sử dụng phương pháp phân lập trực tiếp. Tuy nhiên, protoplast phân lập bằng phương pháp gián tiếp có khả năng phân chia cao hơn khi nuôi cấy.
2.2. Nguyên liệu phân lập protoplast
2.2.1. Phân lập protoplast từ lá cây
Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, nguyên liệu cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất (relatively uniform cells), các protoplast thịt lá có sức sống cao, có độ đồng đều về mặt di truyền.
Protoplast phân lập từ lá qua các bước sau: - Khử trùng lá
- Loại bỏ lớp tế bào biểu bì (epidermal cell layer)
- Xử lý enzyme trong điều kiện áp suất thẩm thấu thích hợp - Phân lập protoplast bằng phương pháp lọc và ly tâm.
Mẫu lá được lấy từ cây còn non hoặc lấy mẫu lá từ cây in vitro có độ sinh trưởng mạnh, có diện tích lá lớn.
Trong trường hợp lấy mẫu lá từ cây trồng tự nhiên thường lấy lá ở những cây khoảng 10 tuần tuổi. Với lá cây khó tách bỏ lớp biểu bì (lá các cây họ hòa thảo) thì được cắt thành lát dài, mảnh trước khi đưa vào xử lý dung dịch enzyme để phân lập protoplast. Quá trình cắt mẫu lá được thực hiện trong dung dịch gây tiền co nguyên sinh.
Ví dụ, trong trường hợp phân lập protoplast lá khoai tây, mẫu lá được cắt nhỏ trong dung dịch 9,1% manitol + 0,01% CaCl2.2H2O, ủ trong dung dịch 15 – 20 phút, sau đó loại dung dịch và bổ sung dung dịch enzyme.
2.2.2. Phân lập protoplast từ callus
Callus là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…).
Các callus non nuôi cấy in vitro cũng là nguyên liệu lý tưởng để thu được một lượng lớn protoplast. Nuôi cấy các callus già hơn thường cho các tế bào có kích thước lớn hơn và vách tế bào dà y, điều này sẽ gây khó khăn cho sự thủy phân bằng enzyme . Vì thế, người ta thường sử dụng các callus non đang trong giai đoạn tăng trưởng tích cực (sau hai tuần cấy chuyển) để phân lập protoplast.
Phương pháp phân lập protoplast từ callus cũng tương tự như đối với lá. Tuy nhiên, nồng độ enzyme đặc biệt là cellulase có thể thấp hơn.
Các cây tái sinh từ quần thể tế bào đơn (single cells) có thể duy trì đầy đủ các đặc tính bảo toàn cao của giống hoặc dòng nhưng vẫn có thể thay đổi một số tính trạng như mong muốn.
Ví dụ: Các cây mía đường có nguồn gốc từ các tế bào callus mang đầy đủ các đặc điểm của bố mẹ, nhưng một vài tính trạng đã được cải thiện như kháng bệnh , tăng sản lượng và hàm lượng đường cao hơn. Gần đây, người ta thường phân lập protoplast từ callus để tạo ra các tế bào đơn , dẫn đến kết quả là thu được các protoclones khác nhau (protoplast propagated clones) ở các loài cây trồng quan trọng trong nông nghiệp.
2.2.3. Phân lập protoplast từ dịch huyền phù tế bào
Huyền phù tế bào là một môi trường lỏng được lắc liên tục, trong đó có sự hiện diện của những tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi, có thể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn (Henshaw và cộng sự, 1965; Torres, 1989).
Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào (cell suspension cultures) đang trong trạng thái tăng trưởng mạnh cũng cung cấp nguồn nguyên liệu rất tốt cho phân lập protoplast .
Dịch huy ền phù tế bào có mật độ cao được ly tâm , sau đó loại bỏ thể nổi (supernatants). Các tế bào được ủ trong hỗn hợp enzyme (cellulase + pectinase) và lắc từ 6 giờ tới qua đêm tùy thuộc vào nồng độ của các enzyme. Sử dụng nồng độ thấp của các enzyme mục đích ngăn cản sự kết dính trong dịch huyền phù tế bào , làm giảm số lượng cụm tế bào và tăng lượng tế bào đơn để thu được hiệu suất phân lập protoplast cao hơn.
Các protoplast có nguồn gốc từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có tiềm năng tái sinh cây hơn hẳn ở các loài mà trước đó đã không thành công khi thử tái sinh từ các protoplast có nguồn gốc tế bào thịt lá . Những thành công gần đây khi tái sinh cây in vitro hoàn chỉn h từ protoplast của các loài ngũ cốc (kê, lúa miến , lúa mạch giống Golden Promise) đã chứng minh nuôi cấy dịch huyền phù tế bào là nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp các protoplast toàn vẹn.
Hình 6.4. Các bước phân lập, nuôi cấy và tái sinh của protoplast
3. NUÔI CẤY PROTOPLAST 3.1. Môi trường nuôi cấy 3.1. Môi trường nuôi cấy
3.1.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy
Nói chung , môi trường nuôi cấy protoplast tương tự với môi trường nuôi cấy dịch huyền phù tế bào và callus . Tuy nhiên, protoplast không còn thành tế bào, chúng có khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng trực tiếp từ môi trường nuôi cấy, vì vậy nồng độ của Fe, Zn và NH4
đối với nuôi cấy protoplast. Hầu hết muối của môi trường B5 và MS có cải biến một ít là thích hợp. Tăng nồng độ Ca2+trong môi trường nuôi cấy protoplast từ 2-4 lần so với bình thường có lợi cho việc duy trì tính toàn v ẹn của màng tế bào . Nồng độ sucrose thích hợp thường từ 3-5%, nhưng ở một số loài (ví dụ: thuốc lá) sucrose được sử dụng ở nồng độ thấp hơn (1,5%). Môi trường nuô i cấy protoplast sử dụng N hữu cơ dạng CH và N vô cơ dạng NH4NO3 (20 mM).
Các vitamin dùng trong nuôi cấy protoplast cũng giống trong môi trường nuôi cấy mô tiêu chuẩn . Auxin và cytokinin sử dụng ở các tổ hợp nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo vách tế bào và kích thích phân chia trong các p rotoplast phân lập . Protoplast của ngũ cốc đòi hỏi cung cấp 2,4-D riêng rẽ hoặc tốt hơn là phải phối hợp với cytokinin.
Tuy nhiên 2,4-D cũng như các auxin khác (NAA, IAA) được sử dụng riêng rẽ thường làm mất tiềm năng phát sinh hình thái ở các callus có nguồn gốc protoplast . Các cytokinin thường được sử dụng là BAP, kinetin, 2-iP, hoặc zeatin.
Mặc dù , tổ hợp hai loại phytohormone nói trên thay đổi tùy loài , nhưng nói chung trong nuôi cấy protoplast tỷ lệ auxin/kinetin cao thích hợp cho phân chia tế bào, trong khi các protoplast có nguồn gốc từ những tế b ào phân hóa cao lại cần tỷ lệ kinetin/auxin cao để tái sinh cây.
Kao và Michayluk (1975) đã xây dựng môi trường nuôi cấy protoplast (KM 8p) trong đó các protoplast được nuôi cấy riêng rẽ (ví dụ: Vicia hajastana) có khả năng phân chia cho tới khi tạo thành callus (khử trùng bằng phương pháp lọc).
Bảng 6.2. Môi trường KM 8p dùng cho nuôi cấy protoplast
Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) Muối khoáng NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 KCl Sequestrence 330 Fe KI H3BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 600 1900 600 300 170 300 28 0,75 3 10 2 0,25 0,025 0,025
Các acid hữu cơ
(chỉnh pH tới 5,5 bằng NH4OH) Sodium pyruvate Citric acid Malic acid Fumaric acid Các vitamin Inositol Nicotinamide Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl D-Calcium pantothenate Folic acid p-Aminobenzoic acid 5 10 10 10 100 1 1 10 0,5 0,2 0,01 Đường Biotin 0,005
Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) Glucose Sucrose Fructose Ribose Xylose Mannose Rhamnose Cellobiose Sorbitol Mannitol 68400 125 125 125 125 12 125 125 125 125 Choline chloride Riboflavin Ascorbic acid Vitamin A Vitamin D3 Vitamin B12 0,5 0,1 1 0,005 0,005 0,01 Các phytohormone 2,4-D Zeatin NAA Vitamin-free casamino acid
Nước dừa (lấy từ quả già xử lý 60o
C/30 phút rồi lọc)
Đậu tương × lúa mạch 1 0,1 - 125 10 ml/L
Đậu tương ×đậu Hà Lan hoặc N. glauca 0,2 0,5 1 - -
3.1.2. Áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy
Sự duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy là yếu tố cần thiết cho sự ổn định, khả năng sống và sự phát triển tiếp theo của protoplast.
Trong quá trình phân lập và nuôi cấy , các protoplast cần đ ược duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường và nội bào cho tới khi tái s inh được vách tế bào vững chắc.
Trong cả hai t rường hợp chênh lệch áp suất thẩm thấu giữa môi trường và nội bào theo hướng môi trường nhược trương hoặc ưu trương sẽ dẫn đến tình trạng
protoplast bị vỡ hoặc teo lại.