2.1. Các phương pháp phân lập protoplast
2.1.1. Phương pháp cơ học (không dùng các enzyme)
Phương pháp này được đề xuất và sử dụng từ năm 1982 (Nguyễn Quang Thạch, 2009).
Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắt nhọn (sharp-edged knife) và giải phóng các protoplast riêng rẽ , bao gồm các bước sau:
- Gây co nguyên sinh làm khối nguyên sinh chất tách khỏi thành tế bào
- Dùng dao cắt khối mô đã được gây co nguyên sinh, lúc này các khối nguyên sinh chất dưới tác động cơ giới có thể tách rời khỏi thành tế bào, giải phóng ra ngoài dung dịch chiết tách.
Phương pháp này thích hợp để tách protoplast từ các tế bào có không bào của các mô dự trữ như chồi hành và vảy hành (bulbs and scales) của các loài thân hành, rễ củ cải (radish root), vỏ quả giữa của dưa chuột (mesocarp of cucumber ), và rễ củ cải đường (beet root).
Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất phân lập protoplast thấp và không thích hợp để tách protoplast từ mô phân sinh cũng như những tế bào không có không bào, và hiện nay phương pháp này gần như không được sử dụng.
2.1.2. Phương pháp sử dụng enzyme
Ngày nay phương pháp phân lập protoplast chủ yếu là phương pháp sử dụng enzyme. Phương pháp này cho phép phân lập được protoplast từ nhiều nguồn thực vật khác nhau trừ những tế bào đã bị hóa gỗ.
Protoplast được phân lập từ phương pháp này ít bị biến dạng, có sức sống cao, có khả năng phân chia và tái sinh cao.
Phương pháp sử dụng enzyme được bắt nguồn từ kết quả nghiên cứu của Cocking (1960) đã tìm được các enzyme phân giải thành tế bào và thu được protoplast. Phương pháp dùng enzyme có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp cơ học , phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast.
Để phá vỡ thành tế bào, người ta thường dùng các loại enzyme chiết xuất từ các sinh vật chứa nhiều enzyme phân giải thành tế bào như: nấm, ốc và mối.
Trong các chế phẩm enzyme này đều có chứa enzyme cellulase, là loại enzyme tham gia phân cắt cellulose có rất nhiều ở thành tế bào mà không ảnh hưởng đến màng tế bào và các thành phần khác có trong tế bào thực vật.
Ngoài enzyme cellulase ra, trong các chế phẩm enzyme còn chứa nhiều loại enzyme khác như hemicellulase, pectinase, lignase. Các enzyme này có thể được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với nhau.
Bảng 6.1. Các enzyme thương phẩm thích hợp cho phân lập protoplast
STT Enzyme Nguồn thu nhận
1 Các enzyme cellulase Cellulase Onozuka R-10 Cellulase Onozuka RS Cellulase YC Cellulase CEL Cellulysin Meicelase P-1 Driselase Trichodema viride T. viride T. viride T. viride T. viride T. viride Irpex lacteus
STT Enzyme Nguồn thu nhận 2 Các enzyme Hemicellulase Helicase Hemicellulase Hemicellulase H-2125 Rhozyme HP 150 Helix pomatia Aspergillus niger Rhizopus sp. Aspergillus niger 3 Các enzyme Pectinase Macerase Macerozyme R-10 PATE Pectinol Pectolyase Y-23 Zymolyase Rhizopus arrhizus R. arrhizus Bacillus polymyxa Aspergillus sp. Aspergillus japonicus Arthrobacter luteus
Hình 6.2. Phân lập protoplasts của Echinacea purpurea a. Phương pháp trực tiếp (sử dụng enzyme đồng thời)
Phương pháp này sử dụng dung dịch hỗn hợp enzyme chứa đồng thời:
pectinase làm nhiệm vụ phân giải pectin - là chất gắn kết các tế bào trong mô,
hemicellulase phân giải hemicellulose và cellulose phân giải cellulose của thành tế bào.
Thông thường hỗn hợp enzyme chứa 0,5% pectinase và 2% cellulase và hemicellulase trong dung dịch có nồng độ đường cao (11-13% saccharose) hoặc các chất gây thẩm thấu cao (hoặc 13% manitol hay sorbitol).
pH của dung dịch enzyme 5,4 – 5,8.
b. phương pháp gián tiếp(sử dụng enzyme theo trình tự)
Phương pháp này khác với phương pháp trực tiếp ở chỗ quá trình phân lập protoplast được thực hiện từng bước với từng enzyme riêng biệt.
Đầu tiên sử dụng pectinase để tách tế bào trong mô thành các tế bào riêng lẻ, sau đó sử dụng enzyme cellulase và hemicellulase để phân lập protoplast.
Ngày nay thường sử dụng phương pháp phân lập trực tiếp. Tuy nhiên, protoplast phân lập bằng phương pháp gián tiếp có khả năng phân chia cao hơn khi nuôi cấy.
2.2. Nguyên liệu phân lập protoplast
2.2.1. Phân lập protoplast từ lá cây
Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, nguyên liệu cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất (relatively uniform cells), các protoplast thịt lá có sức sống cao, có độ đồng đều về mặt di truyền.
Protoplast phân lập từ lá qua các bước sau: - Khử trùng lá
- Loại bỏ lớp tế bào biểu bì (epidermal cell layer)
- Xử lý enzyme trong điều kiện áp suất thẩm thấu thích hợp - Phân lập protoplast bằng phương pháp lọc và ly tâm.
Mẫu lá được lấy từ cây còn non hoặc lấy mẫu lá từ cây in vitro có độ sinh trưởng mạnh, có diện tích lá lớn.
Trong trường hợp lấy mẫu lá từ cây trồng tự nhiên thường lấy lá ở những cây khoảng 10 tuần tuổi. Với lá cây khó tách bỏ lớp biểu bì (lá các cây họ hòa thảo) thì được cắt thành lát dài, mảnh trước khi đưa vào xử lý dung dịch enzyme để phân lập protoplast. Quá trình cắt mẫu lá được thực hiện trong dung dịch gây tiền co nguyên sinh.
Ví dụ, trong trường hợp phân lập protoplast lá khoai tây, mẫu lá được cắt nhỏ trong dung dịch 9,1% manitol + 0,01% CaCl2.2H2O, ủ trong dung dịch 15 – 20 phút, sau đó loại dung dịch và bổ sung dung dịch enzyme.
2.2.2. Phân lập protoplast từ callus
Callus là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…).
Các callus non nuôi cấy in vitro cũng là nguyên liệu lý tưởng để thu được một lượng lớn protoplast. Nuôi cấy các callus già hơn thường cho các tế bào có kích thước lớn hơn và vách tế bào dà y, điều này sẽ gây khó khăn cho sự thủy phân bằng enzyme . Vì thế, người ta thường sử dụng các callus non đang trong giai đoạn tăng trưởng tích cực (sau hai tuần cấy chuyển) để phân lập protoplast.
Phương pháp phân lập protoplast từ callus cũng tương tự như đối với lá. Tuy nhiên, nồng độ enzyme đặc biệt là cellulase có thể thấp hơn.
Các cây tái sinh từ quần thể tế bào đơn (single cells) có thể duy trì đầy đủ các đặc tính bảo toàn cao của giống hoặc dòng nhưng vẫn có thể thay đổi một số tính trạng như mong muốn.
Ví dụ: Các cây mía đường có nguồn gốc từ các tế bào callus mang đầy đủ các đặc điểm của bố mẹ, nhưng một vài tính trạng đã được cải thiện như kháng bệnh , tăng sản lượng và hàm lượng đường cao hơn. Gần đây, người ta thường phân lập protoplast từ callus để tạo ra các tế bào đơn , dẫn đến kết quả là thu được các protoclones khác nhau (protoplast propagated clones) ở các loài cây trồng quan trọng trong nông nghiệp.
2.2.3. Phân lập protoplast từ dịch huyền phù tế bào
Huyền phù tế bào là một môi trường lỏng được lắc liên tục, trong đó có sự hiện diện của những tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi, có thể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn (Henshaw và cộng sự, 1965; Torres, 1989).
Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào (cell suspension cultures) đang trong trạng thái tăng trưởng mạnh cũng cung cấp nguồn nguyên liệu rất tốt cho phân lập protoplast .
Dịch huy ền phù tế bào có mật độ cao được ly tâm , sau đó loại bỏ thể nổi (supernatants). Các tế bào được ủ trong hỗn hợp enzyme (cellulase + pectinase) và lắc từ 6 giờ tới qua đêm tùy thuộc vào nồng độ của các enzyme. Sử dụng nồng độ thấp của các enzyme mục đích ngăn cản sự kết dính trong dịch huyền phù tế bào , làm giảm số lượng cụm tế bào và tăng lượng tế bào đơn để thu được hiệu suất phân lập protoplast cao hơn.
Các protoplast có nguồn gốc từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có tiềm năng tái sinh cây hơn hẳn ở các loài mà trước đó đã không thành công khi thử tái sinh từ các protoplast có nguồn gốc tế bào thịt lá . Những thành công gần đây khi tái sinh cây in vitro hoàn chỉn h từ protoplast của các loài ngũ cốc (kê, lúa miến , lúa mạch giống Golden Promise) đã chứng minh nuôi cấy dịch huyền phù tế bào là nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp các protoplast toàn vẹn.
Hình 6.4. Các bước phân lập, nuôi cấy và tái sinh của protoplast