3. PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐƠN BỘI INVITRO
3.1. Phương thức phát sinh cây đơn bội
3.1.1. Phương thức tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn
Kỹ thuật tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn độc lập rất khó thực hiện so với nuôi cấy túi phấn. Tuy nhiên, phương pháp này có một số ưu điểm so với nuôi cấy túi phấn:
+ Cơ hội tái sinh của thể nhị bội từ túi phấn bị hạn chế mạnh do sự đào thải những phần mang bộ NST nhị bội trên túi phấn như vách ngăn, vách túi phấn, tế bào sắc tố.
+ Túi phấn không còn hoạt động như rào cản sự vận chuyển các chất khoáng từ môi trường nuôi đến hạt phấn.
+ Do sự đào thải các phần khác mà các chất ức chế như acid abscisic, các chất độc từ cơ chất không còn là vấn đề quan trọng.
+ Có thể tránh được sự tạo callus từ túi phấn, kết quả là ít tạo ra thể khảm hơn. Nếu như callus phát triển từ một hạt phấn thì các tế bào của callus có dùng kiểu gen, còn nếu callus phát triển từ nhiều hạt phấn thì ta sẽ có callus khảm về mặt di truyền.
+ Sự biến nạp trực tiếp thường xảy ra từ giai đoạn hạt phấn cho đến khi phôi được hình thành.
+ Các thao tác trên bộ gen và các nghiên cứu về đột biến trên hạt phấn thuận tiện hơn là trên túi phấn.
+ Sự hình thành phôi từ hạt phấn dễ quan sát thấy hơn trong túi phấn.
Bên cạnh những thuận lợi trên thì thực tế vẫn khó có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của hạt phấn độc lập để tạo thể đơn bội. Môi trường sử dụng nuôi cấy hạt phấn phức tạp hơn môi trường nuôi cấy túi phấn nhiều nhưng số lượng cá thể đơn bội được tạo ra ít hơn rất nhiều.
Tuy nhiên, hiện nay các nhà nghiên cứu đã nuôi cấy thành công hạt phấn của các loài: Brassica napu, Lycopersicon, Datura innoxia,…
- Nguyên lý: Nuôi cấy hạt phấn đơn bội (tiểu bào tử) tách rời, hoặc bao phấn có chứa hạt phấn đơn bội trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp để kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội.
- Có hai phương pháp cơ bản được sử dụng để nuôi cấy bao phấn, hạt phấn: + Các bao phấn được nuôi trên môi trường đặc hoặc môi trường lỏng. Sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn, từ đó hình thành cây đơn bội.
+ Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn bằng phương pháp cơ học hoặc do sự tách rời tự nhiên từ bao phấn, được nuôi trong môi trường lỏng, từ đó tạo cây đơn bội. Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của thực vật được gọi là sinh sản đơn tính đực. Người ta phân biệt 3 phương thức sinh sản đơn tính đực:
a. Sinh sản đơn tính trực tiếp từ tiểu bào tử
Tiểu bào tử trong bao phấn → Phôi →Cây đơn bội (n = 1)
Cấu trúc dạng phôi (embryoid) phát triển trực tiếp từ hạt phấn . Quá trình này thường xảy ra trong bao phấn, điển hình là: Datura, Nicotiana, Atroppa.
b. Sinh sản vô tính qua callus
Tiểu bào tử trong bao phấn → Callus →Chồi →Cây đơn bội (n = 1)
Cây hoàn chỉnh phát triển từ khối callus , khối mô này thường phát triển ra ngoài bao phấn, ví dụ: Oryza, Brassica, Lolium, Hordeum.
Kiểu phát triển này không thuận lợi vì có nhiều thể có mức độ bội thể khác nhau được tạo thành do: sự dị hợp tử tự nhiên của vật liệu khởi đầu (đơn bội, nhị bội), sự bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, sự biến đổi tự nhiên từ dạng đơn bội sang nhị bội. Các mô đơn bội thường không cạnh tranh được với các mô độ bội thể cao hơn.
c. Sinh sản đơn tính hỗn hợp
Giai đoạn phát triển callus xảy ra rất ngắn và khó nhận biết , ví dụ : Datura, Lycopersicum (chưa chắc chắn).
- Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn:
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội là kỹ thuật khá phức tạp, phụ thuộc vào yếu tố như: Kiểu gen của cây cho bao phấn, trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn, nhân tố thành bao phấn,…Tuy nhiên, nuôi cấy bao phấn có một số bước cơ bản như sau:
+ Chọn bao phấn:
Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định trong việc tạo cây đơn bội, thích hợp nhất là bao phấn chứa hạt phấn bắt đầu từ thể 4 nhân đến ngay sau khi
nguyên phân lần thứ nhất. Bao phấn của những hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của các hoa muộn.
+ Xử lý nụ hoa:
Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy nhằm kích thích sự phân chia của tiểu bào tử và từ đó tạo thành cây đơn bội. Chế độ xử lý nhiệt phụ thuộc vào loài cây.
Hạt phấn của cây chè (Camellia sinensis) thì xử lý ở nhiệt độ 30-350
C trong khoảng thời gian từ 2 đến 5h trước khi nuôi cấy ở nhiệt ở 250C sẽ cho tỷ lệ hình thành callus và cho các thể phân sinh cao (Saher và Bhattacharya, 1988).
Một số tác giả khác cho rằng, xử lý nụ hoa lúa nước (Oryza sativa) loài phụ
Japonica ở nhiệt độ 100
C trong 2-3 tuần, còn loài phụ Indica thì ở 70C trong 1 tuần; xử lý hoa thuốc lá (Nicotinia tabacum) ở 2-50C trong khoảng 2-3 ngày sẽ thuận lợi cho việc nuôi cấy bao phấn để tạo cây đơn bội.
- Chọn môi trường tái sinh thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy hạt phấn, bao phấn mà ta chọn lựa môi trường thích hợp tương ứng để tạo ra cây đơn bội. Tuy nhiên, cũng có một số nguyên tắc chung.
+ Các cây thuộc họ hòa thảo cần hàm lượng auxin cao, đặc biệt là 2,4 D để kích thích sự phân bào.
+ Các cây họ cà thì cần hàm lượng auxin ít hơn
+ Hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy cao. Tùy theo đối tượng nuôi cấy mà môi trường có hàm lượng đường khác nhau. Đối với ngô cần 60-120g g/L, lúa nước cần 50-60 g/L, còn đối với cây cà lại cần 20-40 g/L,…
+ Các nguồn chất hữu cơ bổ sung và chất phụ gia: Các nguồn chất hữu cơ bổ sung không xác định được như dịch chiết khoai tây, nước dừa, dịch chiết nấm men,… có tác dụng đối với việc nuôi cấy bao phấn của nhiều loại thực vật. Môi trường nuôi cấy cho thêm 100 g dịch chiết khoai tây cho kết quả khá tốt khi nuôi cấy bao phấn các cây thuốc lá, lúa nước và lúa mỳ (Anonymuos, 1966,1967). Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi khi nuôi cấy bao phấn đơn bội. Ví dụ: Than hoạt tính có hiệu quả tích cực khi nuôi cấy bao phấn cây thuốc lá (Anagnostakis, 1974; Bajaj và Heberle1977); nuôi cấy bao phấn lúa mạch đen (Wenzel, Holfmann và Thomas, 1977)…
+ Các nguyên tố vi lượng ít ảnh hưởng trong việc nuôi cấy bao phấn. - Chọn lọc cây đơn bội:
Không phải tất cả các cây được hình thành từ nuôi cấy bao phấn là cây đơn bội. Do vậy vẫn phải xác định chính xác cây đơn bội. Có nhiều cách khác nhau để xác định cây đơn bội như làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái,…
3.1.2. Phương pháp tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh
- Nguyên lý:
Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh còn được gọi là sinh sản đơn tính cái. Nghiên cứu tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh được White (1932) và Maheshwari (1958) tiến hành trên cây Antirhinum và cây Cooperia pedunculata nhưng vẫn chưa có kết quả rõ rệt.
Thành công đầu tiên trong việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh là việc thu nhận được callus đơn bội từ nuôi cấy noãn cây Ginkgo biola (Tulecke,1964).
Do hiện tượng một số loài cây như hành, tỏi, củ cải đường,… việc tạo cây đơn bội bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn, hạt phấn cho cây đơn bội nhưng cây bị bạch tạng. Vì vậy, người ta giải quyết vấn đề khó khăn trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh để tạo cây đơn bội. Đã có nhiều thành tựu trong lĩnh vực này.
- Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh: Về cơ bản kỹ thuật này giống như nuôi cấy bao phấn, hạt phấn. Kết quả nuôi cấy tế bào noãn phụ thuộc vào các yếu tố như kiểu gen của cây mẹ và biến động tùy thuộc loài cây. Những loài cây như hành, tỏi, củ cải đường tỷ lệ nuôi cấy noãn thành công khoảng từ 10-20%, ở lúa nước là 5-12% còn ở dâu tằm là 3-6%. Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh gặp nhiều khó khăn, phức tạp, chủ yếu là do tách tế bào noãn rất khó khăn và khi tách dễ gây tổn thương cho mô.
Để tăng hiệu quả của nuôi cấy tế bào noãn chưa thụ tinh tạo cây đơn bội, người ta kết hợp nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt,…Hiện nay, nuôi cấy noãn chưa thụ tinh ở các cây ngũ cốc như lúa, ngô dễ thành công hơn cả. Người ta đã nuôi cấy được nhiều noãn từ một bắp ngô non chưa thụ phấn và tạo ra hạt ngô đơn bội in vitro đạt tỷ lệ 4-5%.