3. MỘT SỐ KẾT QUẢ BIẾN NẠP Ở THỰC VẬT
3.1. Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gen thành công
Nói chung, hầu hết các loài thực vật đều có thể biến nạp được gen . Các loài cây trồng chính đã được biến nạp gen thành công (Bảng 6.2). Thông thường, hiệu quả biến nạp gen khác nhau tùy thuộc vào từng loại cây trồng , và dĩ nhiên quá trình biến nạp gen vẫn còn bị hạn chế ở nhiều loài
Cây ngô biến nạp gen đầu tiên tái sinh từ protoplast được biến nạp bằng xung điện đã bất thụ (Rhodes và cs 1988). Tuy nhiên, có thể dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh các cây hữu thụ mang gen biến nạp , sử dụng phương pháp bắn gen và chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gen.
Bảng 8.2. Các cây trồng chính đã được biến nạp gen
Stt Loài Phương pháp biến nạp gen
Thử nghiệm trên đồng ruộng
1 Chuối Bắn
gen/Agrobacterium
-
2 Luá mạch Bắn gen Kháng vi rus
3 Đậu tây Bắn gen -
4 Canola Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ, điều khiển sự thụ phấn 5 Sắn Bắn gen/Agrobacterium - 6 Ngô Bắn gen/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ 7 Bông Bắn gen/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ 8 Đu đủ Bắn gen/Agrobacterium Kháng virus 9 Đậu phụng Bắn gen/Agrobacterium Kháng virus 10 Bạch dương Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ
11 Khoai tây Agrobacterium Kháng côn trùng, kháng
virus, chống chịu chất diệt cỏ
12 Lúa Bắn
gen/Agrobacterium
Chống chịu chất diệt cỏ
13 Đậu tương Bắn
gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 14 Bí Bắn gen/Agrobacterium Kháng virus 15 Củ cải
đường Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ
16 Mía Bắn gen -
Stt Loài Phương pháp biến nạp gen
Thử nghiệm trên đồng ruộng
dương
18 Cà chua Agrobacterium Quả chín muộn, kháng
virus
19 Lúa mì Bắn gen -
Các cây biến nạp gen hữu thụ đã được tái sinh , ổn định di truyền và biểu hiện gen bar (kháng chất diệt cỏ glufosinate kh ông chọn lọc) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau . Hiện nay, biến nạp gen ở ngô bằng phương pháp bắn gen được sử dụng rộng rãi . Gần đây, các kết quả biến nạp gen gián tiếp ở ngô nhờ Agrobacterium cũng đã được thông báo. Các thể biến nạp gen của dòng ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung (cocultivation) giữa vector “super -binary” với phôi non . Tần số được thông báo ở dòng A 188 là khoảng 5-30%. Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4-5,3% (tính theo số cây biến nạp gen độc lập/phôi).
3.1.2. Cây lúa
Kết quả tái sinh của cây lúa biến nạp gen bằng xung điện hoặc PEG thông qua nuôi cấy protoplast được thông báo lần đầu tiên cách đây chưa hơn 10 năm. Các nghiên cứu sau đó cũng đã sử dụng hai kỹ thuật này để biến nạp gen vào protoplast và phục hồi các cây biến nạp gen hữu thụ. Tuy nhiên, hạn chế của hai phương pháp này là phải xây dựng phương thức tái sinh cây từ tế bào đơn . Mặc dù các phương thức này đang dùng cho một số giống lúa thuộc loài phụ japonic a (chẳng hạn: Taipei 309) nhưng hầu hết các giống japonica ưu tú cũng như phần lớn các giống indica là khó tái sinh cây từ protoplast.
Phương pháp bắn gen cho phép thực hiện biến nạp gen hiệu quả ở lúa trong các kiểu gen độc lập, và hiện nay hơn 40 giống đã được biến nạp gen thành công . Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành . Hygromycin B là marker chọn lọc thường được dùng cho lúa . Tần số biến nạp có thể cao tới 50% (tính theo số cây biến nạp gen có nguồn gốc độc lập/số mẫu được bắn gen).
Gần đây , kỹ thuật biến nạp gen ở lúa thông qua Agrobacterium cũng đã có những cải tiến quan trọng có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gen.
3.1.3. Cây lúa mì
Phương pháp bắn gen cũng được sử dụng để biến nạp gen ở lúa mì . DNA ngoại lai được bắn vào trong các vảy nhỏ (scutellum) của phôi non của hai giống mùa xuân và một giống mùa đông.
Các callus chốn g chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố ức chế trao đổi chất tương tự như basta , bialaphos hoặc glufosinate ammonium . Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và kết quả là một số lớn cây thất thoát. Phân tích di truyền và phân tử đã xác nhận sự hợp nhất ổn định của các gen biến nạp. Nói chung, công nghệ di truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gen.
3.1.4. Cây lúa mạch
Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn các cây lúa mạch biến nạp gen độc lập, tự thụ phấn. Các phôi hợp tử non , các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc t ừ tiểu bào tử hạt phấn đã được dùng để bắn gen với plasmid mang gen
bar và gusA đơn độc hoặc phối hợp với plasmid khác mang gen protein vỏ của virus gây bệnh lùn vàng ở lúa mạch . Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để ph ân lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của gen.
3.1.5. Cây đậu tương
Những cố gắng đầu tiên ở cây đậu tương biến nạp tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi . Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gen vẫn đang còn gặp nhiều khó khăn.
Công nghệ biến nạp gen ở đậu tương đã có triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hóa của kỹ thuật bắn gen . Thực tế, đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền.
Kết quả đầu tiên ở đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gen nhờ
Agrobacterium. Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm vớ i Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate . Có thể biến nạp gen hiệu quả vào protoplast đậu tương bằng các phư ơng thức thông dụng nhưng rất khó tái sinh được cây.
Để biến nạp gen vào các giống đậu tương khác nhau người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản - phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh của cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh của trụ phôi ) với sự tăng gia tốc của vi đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai.
Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều phenotype khác nhau. Nói chung, ở các dòng đậu tương biến nạp gen có nhiều bản sao của các gen biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50 nhưng thường thay đổi từ 2-10). Phân tích DNA (southern blot) ở thế hệ sau của các bản sao ge n phức cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời , như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên.
3.1.6. Cây đậu tây
Cho đến nay, việc nghiên cứu biến nạp gen ở Phaseolus thành công rất ít . Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng
Agrobacterium và bắn gen . Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả nă ng phục hồi các cây biến nạp.
Cây đậu tây biến nạp biểu hiện các gen gusA, bar và protein vỏ của virus khảm màu vàng đã được phục hồi . Các cây biến nạp gen qua năm thế hệ tự thụ phấn vẫn không mất các gen biến nạp hoặc k hả năng biểu hiện . Kỹ thuật bắn gen cũng được sử dụng để biến nạp gen gusA được điều khiển bằng promoter concanavalin A , hoạt tính
gus đã biểu hiện trong lá mầm và vỏ hạt của các cây biến nạp.
Phương thức biế n nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gen vào cây bông giống Coker 312 (Umbeck 1987). Cây bông biến nạp gen cũng của giống trên đã được phục hồi sau khi bắn gen vào dịch huyền phù nuôi cấy phát sinh phôi (Finer và McMullen 1990). Hầu hết các giống bông có giá trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus . Một số ít các giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô tính (somaclonal variation).
Phương thức phân phối gen ngoại lai trực tiếp vào trong mô phân sinh của trụ phôi dựa trên công nghệ ACCELL cũng được phát triển và đã phục hồi cây biến nạp gen.
Hình 8.10. Sự tái sinh của lá mầm cà chua chuyển gen ctb
Hình 8.11. Tái sinh cây từ callus mía
A: Callus được biến nạp gen ctb chọn lọc có kháng sinh B: callus đối chứng tái sinh trên môi trường bình thường
A B
C D
Hình 8.12. Tái sinh chồi từ cuống lá rau má chuyển gen ltb.
A: Chồi tái sinh cây từ cuống lá không chuyển gen trên môi trường bình thường; B: Chồi tái sinh cây từ cuống lá không chuyển gen trên môi trường chọn lọc; C:
Chồi tái sinh cây từ cuống lá chuyển gen ltb trên môi trường chọn lọc; D: Chồi rau má chuyển gen ltb .
A B
Hình 8.13. Tái sinh chồi từ cuống lá cây càng cua
A: chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen LTB trên môi trường chọn lọc; B:cây chuyển gen LTB
3.2. Biến nạp gen nif
Ở một số loài vi khuẩn và tảo lam sống tự do hoặc cộng sinh tồn tại phương thức biến đổi nitơ phân tử của khí trời thành dạng NH3.
Nitrogenase
N2 ... NH3
Quá trình cố định nitơ tự do của khí trời xảy ra n hờ một loại enzyme là nitrogenase (nitrogen fixation gene -gọi tắt là gen nif) chỉ tồn tại ở một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu (Fabaceae). Dùng kỹ thuật gen tách gen nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển sang các cây trồng quan trọng như lúa , ngô là một mô hình lý tưởng của các nhà tạo giống.
Quá trình cố định đạm thông qua enzyme nitrogenase phải xảy ra trong điều kiện yếm khí nghĩa là không có mặt O 2 ở vùng phản ứng . Điều kiện này được thực hiện ở các nốt sần cây họ đậu như một loại protein là leghemoglobin hoặc legoglobin (gắn O2 như hemoglobin của máu).
Muốn cho nitrogenase hoạt động trong tế bào thực vật bậc cao phải t ạo ra được vùng phản ứng sạch O2 hoặc đưa vào tế bào một cơ chế bảo vệ như legoglobin . Đó là một vấn đề lớn mà kỹ thuật contransformation (chuyển nạp liên hợp gen ) đang tìm cách giải quyết.
4. TRIỂN VỌNG VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN
Trong những năm qua , các phương pháp biến nạp gen ở thực vật bậc cao đã có rất nhiều tiến bộ.
Hiện nay, các phòng thí nghiệm công nghệ gen đang bắt tay vào việc cải thiện có ý nghĩa cho một số loài cây trồng nhờ các công cụ của sinh học tế bào và sinh học phân tử. Trong một vài trường hợp đặc biệt (đậu tương, lúa, ngô và bông) các phương pháp biến nạp gen bị giới hạn bởi genotype . Một số các cây trồng quan trọng cần thiết cho nhu cầu sử dụng của người dân ở các nước đang phát triển hiện ít được chú ý.
Công nghệ di truyền thực vật là một bước ngoặt quyết định . Một số cây trồng quan trọng đã được biến nạp gen; một vài vấn đề kỹ thuật vẫn đang còn tồn tại , nhưng chúng đang dần dần được giải quyết . Để có kết quả cần phải thay đổi dần dần sang một phạm vi khác , như là phát hiện và tạo dòng các gen mang các tính trạng đa gen (multigenic traits). Một điều không thể quên là vấn đề nhận thức của xã hội và dự báo nguy cơ tác động xấu đến môi trường do các sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA mang lại.
Hiện nay, công nghệ biến nạp g en đang được quan tâm hơn thông qua các quỹ tài trợ của các cơ quan quốc tế như là chương trình Rockefeller Foundation (Mỹ), và vấn đề đang được thảo luận nhiều là cần thiết xác định phương thức tốt nhất để chuyển các lợi ích do công nghệ biến nạp gen mang lại đến các nước đang phát triển.
Cây biến nạp gen đầu tiên thu được vào năm 1983. Điều này cho phép nhận xét rằng mới chỉ hơn hai thập niên, các công cụ của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào đã giúp ích rất nhiều cho c nác nhà tạo giống thực vật . Việc lựa chọn phương thức sử dụng các cây trồng thu được từ công nghệ DNA tái tổ hợp có thể cung cấp thêm nguồn tài nguyên mới cho công nghiệp và người t iêu dùng, như vậy có thể mở rộng cơ sở kinh tế ở cả các nước công nghiệp lẫn các nước đang phát triển.
Các hướng chính trong chọn tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen:
4.1. Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ
Cỏ dại là loại thực vật mọc không theo mục đích của con người, chúng gây ra ảnh hưởng xấu đến cây trồng. Vì vậy, nền nông nghiệp gắn liền với việc sử dụng thuốc trừ cỏ. Vấn đề đặt ra là khi dùng thuốc trừ cỏ chỉ diệt cỏ mà không ảnh hưởng xấu hay diệt cây trồng. Muốn vậy, người ta phải tạo ra các giống có đặc tính kháng thuốc trừ cỏ. Phương pháp chuyển gen sẽ giải quyết tốt vấn đề này. Người ta sẽ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào cây trồng. Những cây trồng này sẽ không bị ảnh hưởng bởi thuốc trừ cỏ.
Nguyên tắc chung là phải tìm được gen kháng lại cơ chế gây hại của thuốc trừ cỏ như: nâng cao hoạt tính của các enzyme bị hại do thuốc trừ cỏ, tạo ra các enzyme đột biến không bị ảnh hưởng bởi thuốc trừ cỏ, tạo các enzyme làm mất tính độc của thuốc trừ cỏ,…
Ví dụ: Thuốc glyphosat là một loại thuốc trừ cỏ được dùng phổ biến vì chúng có tác dụng diệt cỏ cao, dễ phân giải và ít gây ô nhiễm môi trường. Cơ chế hại của thuốc là kìm hãm hoạt động của enzyme enol pyruvat sikimat phosthat synthetase (EPSPS). Enzyme này biến đổi sản phẩm quang hợp thành acid mang mạch vòng. Cơ thể thực vật nếu thiếu acid này sẽ bị rối lo toàn bộ quá trình trao đổi chất và chết. Người ta đã tìm được các gen mã hóa EPSPS có hoạt tính rất cao, cải biến chúng và chuyển vào cây trồng.
Kết quả tạo ra cây có hàm lượng hoạt tính của enzyme EPSPS cao hơn gấp 4 lần so với cây bình thường và hoàn toàn chống chịu với thuốc trừ cỏ glyphosphat. Bằng cách này người ta đã tạo hàng loạt các cây trồng kháng thuốc trừ cỏ như cây đậu tương, ngô, cây bông,…
4.2.Chuyển gen kháng sâu
Hơn 30 năm nay, trong sản xuất người ta đã sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt do
vi khuẩn Bacillus thuringiensis tạo ra. Vi khuẩn này mang các gen sản sinh ra các ptotein kết tinh rất độc đối với ấu trùng của nhiều loại côn trùng nhưng không độc đối với động vật có xương sống. Người ta đã tách chiết, xác định trình tự tổng hợp thiết kế vào vector và chuyển các gen này vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: bông, lúa, đậu,.. Kết quả tạo ra nhiều giống cây trồng kháng sâu có ý nghĩa. Các nhà khoa học còn tiếp tục cải tiến các gen này để nâng cao hoạt tính độc của chúng.
Ngoài ra, vi khuẩn Bacillus cereus có mang các gen mã hóa cho các protein ức chế hoạt động của enzyme protease làm hỏng quá trình tiêu hóa của côn trùng. Các nhà nghiên cứu đã tách chiết, xác định trình tự tổng hợp thiết kế vào vector và chuyển các gen này vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: ngô, đậu,..