3. NUÔI CẤY PROTOPLAST
3.2. Phương pháp nuôi cấy
3.2.1. Phương pháp nuôi cấy chung
a. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng
Có nhiều phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng
- Protoplast có thể được nuôi trong một lớp mỏng môi trường lỏng bằng đĩa petri. Đĩa này được băng kín miệng bằng parafilm và đặt trong điều kiện ánh sáng yếu hoặc trong tối ở 25 – 28o
C.
- Protoplast được nuôi trong những giọt môi trường trong một đĩa petri. Đĩa petri này phải được đặc trong một hộp ẩm ở điều kiện ánh sáng yếu với nhiệt độ 25 – 28oC.
- Protoplast có thể được nuôi trong bình tam giác thể tích 50 – 100ml, có chứa 5ml môi trường. Bình tam giác này được nuôi trong điều kiện ánh sáng 2500lux ở nhiệt độ 25o
C.
- Protoplast có thể được nuôi trong các lame lõm, trong điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ 25 – 28oC và điều kiện ánh sáng yếu.
b. Phương pháp nuôi trong môi trường đặc
Phương pháp này là dàn mỏng các protoplast trên môi trường đặc. Với phương pháp này có thể thao tác thuận lợi trên một lượng lớn protoplast và dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi.
Trong phương pháp này, 2ml môi trường lỏng có chứa protoplast (mật độ 105 protoplast/ml) sẽ được ly tâm và protoplast được giữ lại trong môi trường lỏng. Huyền phù protoplast được rót vào đĩa petri nhỏ chứa môi trường dinh dưỡng có 1 – 2% agar. Đĩa petri được dán kín bằng parafilm (để ngăn sự mất nước và agar bị đặc lại) và đặt trong điều kiện nhiệt độ 25 – 28o
C.
3.2.2. Các phương pháp nuôi cấy
Phương pháp nuôi protoplast sau khi phân lập cũng như nuôi cấy tế bào đơn, nó phụ thuộc vào phương pháp nghiên cứu. Quá trình phát triển phương pháp nuôi cấy protoplast khá phức tạp, đã có nhiều phương pháp nuôi cấy được nhiều tác giả đề xuất.
a. Phương pháp nuôi trợ dưỡng
Một hướng khác trong nuôi cấy protoplast ở mật độ thấp là phương pháp nuôi trợ dưỡng hay kỹ thuật tầng nuôi dưỡng (feeder layer technique). Raveh và cs (1973)
đã chuẫn bị tầng tế bào nuôi dưỡng bằng cách chiếu xạ tia X (2×103 R) lên các protoplast dịch huyền phù tế bào của thuốc lá, khi đó sự phân chia của tế bào bị ức chế nhưng vẫn cho phép chúng duy trì các hoạt động trao đổi chất.
Các protoplast bị chiếu xạ sẽ được rửa sạch ba lần và sau đó dàn trải chúng trên môi trường có agar mềm (soft agar) ở mật độ 2,4×104/mL. Nuôi cấy trải (plating) các protoplast không qua chiếu xạ ở mật độ thấp (10-100 protoplast/mL) trên tầng nuôi dưỡng này.
b. Phương pháp đồng nuôi cấy
Các protoplast của 2 loài khác n hau cũng được đồng nuôi cấy (co-culture) để kích thích sự sinh trưởng của chúng hoặc của tế bào lai . Nói chung, phương pháp đồng nuôi cấy được sử dụng trong những thí nghiệm mà các callus hình thành từ 2 loại protoplast có thể phân biệt hình thái được.
Ví dụ: Các tế bào lai phân lập một cách cơ học (mechanically isolated hybrid cells) được đồng nuôi cấy với các protoplast phân lập từ chủng bạch tạng (albino strain) sẽ phát triển thành các khuẩn lạ c màu xanh là loại khuẩn lạc dễ phân biệt với các khuẩn lạc không có màu xanh của dạng bạch tạng.
c. Phương pháp nuôi cấy vi giọt
Kỹ thuật nuôi cấy vi giọt (microdrop culture) đã thành công ở trường hợp nuôi cấy các tế bào l ai của Nicotiana glauca (+) Glycine max và Arabidopsis thaliana (+) Brassica campestris. Kỹ thuật này cần đĩa nuôi cấy Cuprak được thiết kế đặc biệt gồm có một ngăn bên ngoài nhỏ và một ngăn bên trong lớn hơn.
Các protoplast riêng rẽ hoặc các thể dị nhân trong giọt môi trường dinh dưỡng (khoảng 0,25-25 µL) được chuyển bằng pipette Drummond vào mỗi ngăn bên trong của đĩa Cuprak . Ngăn bên ngoài chứa đầy nước vô trùng để duy trì độ ẩm bên trong đĩa. Sau khi đậy nắ p, đĩa được quấn giấy parafilm , giữ ở điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tối thích.
Tỷ lệ tế bào /dung tích môi trường nuôi cấy thích hợp tương đương mật độ 2- 4×103/mL. Nếu tăng kích thước giọt (~ 25 µL), tức là giảm mật độ dàn trải sẽ cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn.
d. Phương pháp sàng lọc MDA (multiple drop array)
Potykus và cộng sự, 1977 đã sử dụng công nghệ nuôi cấy nhỏ giọt - MDA để sàng lọc một cách có hệ thống các đa phức chất của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy protoplast. Kỹ thuật sàng lọc MDA là sử dụng tay để nhỏ các giọt như một đơn vị thí nghiệm. Mỗi giọt đặc trưng cho một phức hợp được kiểm tra.
Các giọt này được trải đều trên bề mặt đĩa petri (đường kính 9cm) với mật độ 7 × 7 giọt. Để kiểm tra tổ hợp giữa 7 loại auxin và 4 loại cytokinin khác nhau trong môi trường nuôi cấy, mỗi nhân tố này dùng 7 loại nồng độ khác nhau.
Như vậy, cả thí nghiệm này sẽ gồm 7 × 4 đĩa petri, mỗi đĩa có 49 giọt. Tổng tất cả thí nghiệm sẽ gồm 4 × 7 × 49 = 1372 nhân tố tổ hợp. Trong phương pháp này, thể tích mỗi giọt khoảng 50µl chứa 1 × 104hoặc 1 × 105
protoplast/ml.
Jomes và cộng sự, 1960 lần đầu tiên sử dụng công nghệ nuôi cấy MDA để nuôi cấy protoplast.
Vasil và Hildebrast, 1965 đã cải tiến công nghệ này như sau, sử dụng 30 - 50µl môi trường nuôi cấy chứa một hoặc một số protoplast, nhỏ lên một tiêu bản, sau đó
đậy lam kính lên trên, dán parafilm, nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng bình thường với nhiệt độ 23 – 24o
C.
e. Phương pháp nuôi cấy theo giai đoạn phát triển
Hiện nay đây là phương pháp nuôi cấy phổ biến nhất. Giai đoạn đầu protoplast được nuôi cấy trong môi trường lỏng trong các đĩa petri nhỏ (đường kính 3cm). Sau 2-4 ngày, protoplast bắt đầu tái tạo thành tế bào và phân chia. Sự phân chia hoàn thành sau 2 – 7 ngày và hình thành microcallus sau 2-3 tuần.
Sau đó, microcallus được chuyển sang môi trường thạch cứng trong các đĩa petri lớn hơn (đường kính 9cm) có thành phần môi trường thích hợp cho việc tạo macrocallus. Giai đoạn này kéo dài từ vài tuần đến vài tháng. Sau cùng, các macrocallus được chuyển sang môi trường tái sinh tạo chồi.