THỨ CẤP BẰNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
2.1. Các tồn tại trong sản xuất các chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật
Các tồn tại có thể tổng kết thành 3 nhóm chính - Các vấn đề về sinh học cần giải quyết bao gồm:
+ Cần phát triển các phương pháp phát hiện và đánh giá sản phẩm tốt hơn + Nâng cao được hiệu suất nuôi cấy
+ Nâng cao thể tích, quy mô nuôi cấy
+ Khắc phục hiện tượng tế bào bị mất khả năng tổng hợp chất mong muốn khi nuôi cấy kéo dài
+ Cải tiến các kỹ thuật thu hồi sản phẩm - Các vấn đề về kinh tế
+ Cần lựa chọn sản phẩm có giá trị cao để có thể mang lại lợi nhuận + Cần có thị trường tiêu thụ lớn
+ Cải tiến hệ thống để giảm chi phí.
- Các vấn đề về xã hội: sự chấp nhận của người tiêu dùng với các sản phẩm thu hồi từ nuôi cấy tế bào so với các sản phẩm tự nhiên.
2.2. Chiến lược trong sản xuất các sản phẩm thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào
Mặc dù trong nhiều trường hợp các hợp chất có giá trị chữa bệnh hoàn toàn thu được hoặc được sản xuất nhưng với hàm lượng rất nhỏ thì người ta vẫn có thể tổng kết chung được rằng : Mỗi tế bào đều có khả năng biểu hiện tính toàn thể hóa học cũng như hình thái học.
Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức
cao hơn. Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao 2000, Dixon 1999). Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như (1) chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp, (2) chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, (3) bổ sung tiền chất nuôi cấy và (4) các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004).
Bản chất của các tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro rất phức tạp mà chúng ta chưa hiểu hết được, việc đưa ra các cải tiến nhằm nâng cao hiệu suất nuôi cấy là cần thiết. Sau đây là một số chiến lược chung nhất có thể áp dụng nhằm cải tiến hiệu suất nuôi cấy của bất kỳ đối tượng nào:
- Chọn lọc (selection), sàng lọc (screening) dòng tế bào:
+ Các biến dị luôn gắn liền trong nuôi cấy in vitro có thể trở thành nguồn vật liệu quý giá nếu như được kiểm soát. Tuy nhiên, khi nuôi cấy trên quy mô lớn, yêu cầu tiên quyết đặt ra là phải tạo được các dòng tế bào nuôi cấy ổn định và vì thế các biến dị không kiểm soát là không thể chấp nhận trong quy trình nuôi cấy sinh khối tế bào. Trong những giai đoạn đầu khi thiết lập nuôi cấy, sự sai khác sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu phong phú cho quá trình chòn lọc nhằm tạo được các dòng nuôi cấy sinh trưởng nhanh và có khả năng sản xuất các chất mong muốn cao và ổn định.
+ Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L.
- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
+ Để đạt được hiệu quả kinh tế cao, các môi trường thích hợp cho từng đối tượng nuôi cấy là vô cùng cần thiết. Nếu sự sản xuất liên quan đến sinh trưởng của tế bào thì có thể chỉ cần phát triển một loại môi trường nuôi cấy cho cả quá trình mà vẫn đạt được hiệu quả sản xuất cao. Tuy nhiên, nếu nhiều sản phẩm được hình thành mà không liên quan đến sự sinh trưởng của tế bào thì cần phát triển các môi trường thích hợp cho từng giai đoạn. Các nghiên cứu về môi trường ngoài ra cần chú ý đến sự kết hợp cân đối thành phần, loại chất dinh dưỡng cũng như thể
+ Các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, thể tích môi trường sẽ sử dụng và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi 1999, Lee và Shuler 2000, Wang và cs 1999). Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy.
- Cung cấp tiền chất (precursor feeding).
+ Một trong những chiến lược quan trọng để tăng sản lượng là bổ sung những chất tiền thân đặc hiệu vào một con đường đồng hóa cụ thể để kích thích sự hình thành
một sản phẩm mong muốn có giá trị cao hơn. Việc sử dụng các gốc đồng phân tổng hợp vào các chất tự nhiên có thể dẫn đến sự tổng hợp một hợp chất hoàn toàn mới mà chúng có thể sử dụng làm dược liệu quan trọng.
+ Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy làm tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ.
- Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation)
+ Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor – phát tín hiệu) giúp kích thích sự hình thành và tiết ra các hợp chất thứ cấp mong muốn. Ngoài ra, elecitor còn có khả năng định hướng để tạo ra những hợp chất hoàn toàn mới.
+ Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985). Tuy nhiên, để sử dụng hiệu quả các elicitor, thông tin về các bước trong con đường cung như mạng lưới đồng hóa cần phải được làm sáng tỏ.
- Sự tiết sản phẩm từ tế bào ra ngoài môi trường
+ Vị trí tích lũy cuối cùng của sản phẩm là một trong những thông số quan trọng của một quy trình nuôi cấy. Thông thường các sản phẩm thứ cấp của thực vật được tích lũy trong không bào. Tuy nhiên, có thể làm tăng khả năng sản xuất những chất này bằng cách kích thích cho chúng được tiết ra ngoài môi trường.
+ Sự tích lũy các sản phẩm thứ cấp bên trong tế bào đôi khi lại cản trở chính sự sinh tổng hợp ra chúng do các cơ chế điều hòa. Để cho những hệ thống tế bào thực vật cố định có thể hoạt động, điều cần thiết là phải làm cho một lượng lớn sản phẩm tiết ra ngoài môi trường.
Một vài ví dụ chứng minh cho chiến lược chung mà chúng ta cần phải tuân theo để có thể có được các dòng tế bào có năng suất cao . Đầu tiên là cấy gây nuôi cấy tế bào của loài thực vật sản sinh ra hợp chất chúng ta cần có (nên chọn loài có năng suất cao) và sau đó tiến hành chọn tính ổn định của những dòng tế bào khác nhau từ những cơ thể khác nhau để tìm ra dòng có năng suất cao . Theo phương thức này những dòng tế bào có năng suất alkaloid cao đượ c chọn từ nuôi cấy mô của Catharanthus hoặc những dòng tế bào với hoạt tính hydroxyd hóa cao được chọn từ nuôi cấy của cây
Digitalis. Tuy nhiên, những dòng tế bào Digitalis này cho đến thời điểm hiện tại vẫn không sản sinh ra cardiac glycoside. Kỹ thuật chọn dòng này cũng đã được ứng dụng để chọn ra dòng tế bào sản xuất ra nhiều nicotin từ một dòng tế bào của Nicotiana rustica đã mất hoàn toàn khả năng tổng hợp alkaloid.
Phương pháp chọn dòn g này đã được cải tiến bằng cách kết hợp với những phương pháp phân tích có độ nhạy và tính đặc thù cao hơn , ví dụ miễn dịch phóng xạ . Mặc dù đó không phải là tiền đề cần thiết trong mỗi trường hợp. Đương nhiên, con đường tối ưu nhất vẫn là tìm ra được những phương pháp cho phép xác định những sản phẩm thứ cấp ở ngay trong tế bào sống , chẳng hạn thông qua các chất huỳnh quang UV hay chất có màu sắc nhận thấy được. Thế nhưng trong thực tế rất khó tìm ra
chất màu có khả năng thâm nhập vào không bào là nơi các sản phẩm thứ cấp được tích trữ để vẫn tạo ra phản ứng màu mà không làm chết tế bào.
Sự phân lập các dòng tế bào chịu p -fluorphenylalanine, trong đó có một dòng có hoạt tính enzyme tăng lên và hàm lượng cao các hợp chất fenol tan trong etanol cho thấy một triển vọng khác trong việc chọn dòng tế bào. Đó là cách sử dụng các chất đặc biệt gây áp lực ch ọn lọc để phân lập những tế bào sản xuất dư thừa các sản phẩm thứ cấp thực vật điều đó có thể kiểm nghiệm với những nuôi cấy tế bào tạo alkaloid có nguồn gốc là các acid amin. Tuy nhiên, người ta cần thấy rằng việc sản xuất các amino acid đặc thù này không phải là yếu tố hạn chế duy nhất đối với quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp trong tế bào mà ở đây còn có nhiều yếu tố khác cần đề cập tới. Một bước tiếp theo là phải cải tiến qui trình nuôi cấy bằng cách thay đổi hợp lý môi trường , cũng như nhiều tài liệu đã thông báo người ta thay đổi hàm lượng hormone, đường, vitamin, nhiệt độ... Hàng loạt những biến đổi môi trường , điều kiện nuôi cấy hoặc thay đổi cả dòng tế bào cũng mới chỉ được kiểm nghiệm trong hệ thống kiểm định như phương pháp giọt nhỏ kết hợp với phương pháp miễn dịch phóng xạ. Nghiên cứu thay đổi môi trường nuôi cấy được cải tiến thêm một bước khi kỹ thuậ t nuôi chemostat (thể ổn định hóa tính) được ứng dụng.