TRỒNG
Các đột biến đơn gen trong hệ gen của nhân hoặc cơ quan tử có thể tạo ra một thứ in vitro (in vitro variety) thích hợp nhất có các đặc tính đặc trưng được cải thiện . Trong khuôn khổ tạo giống cây trồng, biến dị dòng soma có thể được sử dụng để khám phá ra các thể biến dị mới duy trì tất cả các đặc tí nh tốt và có bổ sung tính trạng hữu ích, như kháng các bệnh hoặc chất diệt cỏ.
Các biến dị này sau đó có thể được thử nghiệm trên đồng ruộng để xác định chắc chắn sự ổn định di truyền của chúng. Lai thuận nghịch (reciprocal cross) giữa thế hệ F1 mang tính trạng mong muốn với đối chứng có nguồn gốc từ hạt sẽ ổn định xa hơn (further stabilise) các thể biến dị và giúp đỡ tạo hạt giữa các dòng hứa hẹn.
Biến dị dòng giao tử , được cảm ứng hầu hết bởi sự tái tổ hợp giảm phân trong chu trình hữu tính của thể lai F 1, tạo ra sự phân ly vượt quá giới hạn để khám phá ra các tổ hợp gen duy nhất.
Các dòng tế bào khác nhau chọn lọc trong điều kiện in vitro có thể chứng minh năng lực ứng dụng cho nông nghiệp và công nghiệp . Các cây tái sinh biểu hiện các tính trạng kháng chất diệt cỏ , pathotoxin, muối hoặc phèn. Hơn nữa, khả năng biến dị trong nuôi cấy tế bào đã thể hiện một vai trò hữu ích trong việc tổng hợp các chất thứ cấp liên quan đếm phạm vi thương mại.
Các kỹ thuật ứng dụng cho việc cảm ứng biến dị dòng soma và dòng giao tử dễ dàng hơn công nghệ DNA tái tổ hợp.
Đặc biệt, cải thiện cây trồng mang các tính trạng đa gen (polygenic traits) bằng các phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống và không truyền thống đã được chứng minh là rất khó khăn . Biến dị dòng soma có thể là một kỹ thuật thích hợp cho công nghệ di truyền các cây trồng này.
TÓM TẮT CHƯƠNG
Biến dị dòng soma bao gồm biến dị kiểu gen và biến dị kiểu hình thể hiện ở các mô tế bào nuôi cấy. Các biến dị này xuất hiện do sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy hoặc chịu sự tác động của nhiều yếu tố trong quá trình nuôi cấy.
Các tế bào biến dị cá thể được phân lập bằng nhiều phương pháp: không có tác nhân chọn lọc và có tác nhân chọn lọc.
CÂU HỎI
Câu 1: Hãy trình bày cơ sở phân tử của biến dị dòng soma?
Câu 2: Hãy phân tích sự tác động của các yếu tố gây ra biến dị dòng soma trong quá trình nuôi cấy?
Chương 8. BIẾN NẠP DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT
Một trong những hướng phát triển gần đây nhất của nuôi cấy mô và tế bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gen ngoại lai trong tế bào thực vật. Biến nạp của các tế bào vi khuẩn đ ược thực hiện bằng cách chuyển DNA từ một vi khuẩn khác và sự hợp nhất sau đó của DNA ngoại lai này trong nguyên liệu di truyền của vật chủ đã được thiết lập tốt.
Tuy nhiên, việc cải biến di truyền ở thực vật bậc cao bằng cách đưa DNA ngoại lai vào trong các tế bào của chúng là một quá trình rất phức tạp . Sử dụng enzyme hạn chế (restriction endonucleases ) để cắt phân tử DNA sợi đôi thành những đoạn nhỏ riêng rẽ, phát triển kỹ thuật lai DNA -DNA và các gen chỉ thị (marker genes) cho phép chọn lọc các tế bào biến nạp có khả năng hợp nhất DNA ngoại lai trong tế bào ở
Monera, nấm, động vật, và thực vật bậc cao.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin di truyền mới được biến nạp vào các thực vật eukaryote biểu hiện không chỉ ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền lại cho các thế sau của chúng.
Chuyển gen vào cây trồng là một công cụ thiết yếu cho cả những thí nghiệm nghiên cứu về chức năng gen và sự cải thiện vụ mùa bằng việc tăng cường những đặc tính có sẵn hoặc gắn những gen mới vào cây trồng. Bây giờ, nó có thể gắn và biểu hiện bền vững DNA trong những loài cây trồng khác nhau mà không cần quan tâm đến nguồn gốc của chúng, và những khía cạnh của sinh lý thực vật và hóa sinh thì không thể dể dàng chú tâm tới bởi những phương tiện thí nghiệm khác có thể được nghiên cứu bằng sự phân tích chức năng gen và điều hòa những cây chuyển gen.
Việc chuyển DNA vào cây trồng được nghiên cứu đầu tiên vào những năm 1960, do thiếu marker chọn lọc và công cụ phân tử để xác định sự xâm nhập của gen và sự biểu hiện do đó hiệu quả của những thí nghiệm không rõ ràng. Cuối những năm 1970, đã có bước ngoặt trong việc làm sáng tỏ vi khuẩn A. tumefaciens liên quan đến sự hình thành khối u (Van Larebeke và cs, 1974). Việc khám phá ra sự xâm nhập của
A. tumefaciens mang một plasmid lớn có khả năng cảm ứng tạo khối u và một đoạn DNA của plasmid (T-DNA) đã được chuyển đến genome của cây trồng đã cung cấp một công cụ chuyển gen tự nhiên vào cây trồng (Chilton và cs, 1997).
Cây khoai tây mang trình tự T-DNA tái tổ hợp được tái sinh đầu tiên vào năm 1982, mặc dù những gen lạ đã hoạt động dưới sự điều khiển của promoter của nó nhưng đã không được biểu hiện ở tế bào thực vật. Cây khoai tây chuyển gen đầu tiên biểu hiện gen tái tổ hợp trong trình tự xâm nhập T-DNA được công bố năm 1983.
Kỹ thuật biến nạp gián tiếp thông qua A. tumefaciens đã được phát triển và cải tiến, nó đã trở thành kỹ thuật được sử dụng phổ biến cho việc chuyển gen vào các loại cây trồng khác nhau. Đến nay, các kỹ thuật phân tử đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài khác nhau. Lúc đầu người ta sử dụng các gen chỉ thị để biến nạp , nhưng nay đã thay thế bằng các gen quan trọng có giá trị kinh tế nhằm mục đích cải thiện phẩm chất cây trồng.
Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ gen (gene
transformation technology ) ở thực vật bậc cao là : các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại lai vào các loài thực vật khác nhau . Muốn chuyển một gen thành công cần phải chứng minh hiệu quả của phương pháp biến nạp gen , nhưng đôi khi các loài được nghiên cứu hoặc không
thể tái sinh được cây từ các mô không phân hóa, hoặc có thể tái sinh nhưng sau đó khó phát triển thành cây hoàn chỉnh . Do đó, hai nhân tố nói trên thường được nghiên cứu phát triển song song.
Việc tái sinh các cây được chuyển gen chủ yếu phụ thuộc vào các tế bào soma có tính toàn thể (totipotency) mà không phải tế bào soma nào cũng có được khả năng đó. Vì mô là một tập hợp của nhiều tế bào có phản ứng khác nhau khi gặp một yếu tố tác động tới; một số ít tế bào trong cây có khả năng tái sinh và tiếp nhận sự biến nạp; những tế bào khác sẽ chỉ có một trong hai khả năng ấy. Tương quan giữa các quần thể tế bào kiểu như vậy tùy thuộc vào loài, kiểu gen, cơ quan, thậm chí tùy từng vùng trong một cơ quan.
Các thí nghiệm biến nạp gen đầu tiên đã sử dụng Agrobacterium tumefaciens để đưa vào cây thuốc lá các gen kháng kháng sinh . Agrobacterium là vật truyền hữu hiệu để đưa các DNA ngoại lai vào trong các loài thuộc họ Solanaceae, nhưng ở một số cây trồng khác quan trọng hơn việc sử dụng nó còn gặp nhiều hạn chế. Trở ngại lớn nhất là tính đặc trưng vật chủ của Agrobacterium, mặc dù những tiến bộ gần đây đã cho phép ứng dụng thành công trên một số giống cây trồng.
Sự phát triển của các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ callus và protoplast đã mở ra một hướng mới cho công nghệ di truyền thực vật thông qua các phương pháp biến nạp gen trực tiếp . Nhờ sự phát triển của phương pháp bắn gen (particle bombardment )-dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật -việc biến nạp ở các loài cây trồng đã gặp nhiều thuận lợi hơn . Các phương pháp biến nạp khác cũng có hiệu quả đối với từng trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế.
Chẳng hạn: các phương pháp biến nạp gen bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng phần , phương pháp xử lý hóa học bằng PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế bào , phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào , phương pháp biến nạp gen qua ống phấn...
Khi thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như:
- Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng.
- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai.
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome.
- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Tuy nhiên, cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu có điều kiện phù hợp thì sẽ có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây.
- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai. Vì thế, cho đến nay chỉ có thể chuyển vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu
âm và vi tiêm.
- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ thuận với sự biểu hiện tạm thời của gen.
- Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome.
- Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi mà nó được đưa vào.
- Trong khi đó, DNA của virus khi xâm nhập vào genome cây chủ không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem)