3. NHÂN GIỐNG INVITRO VÀ CÁC HỆ THỐNG NUÔI CẤY MÔ
4.2. Giai đoạn II-nhân nhanh
Ở giai đoạn này người ta mới kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là:
- Tạo phôi vô tính: Việc tạo ra tế bào có khả năng sinh phôi giúp cho việc nhân dòng thực hiện một cách nhanh chóng. Trong quá trình này, một tế bào đơn có thể được cảm ứng trở thành một phôi và từ đó phát triển thành một cây nguyên vẹn. Các phôi vô tính là những tổ chức đơn giản được tạo ra từ tế bào soma nhưng sự phát sinh hình thái lại tương tự như phôi hữu tính.
- Phát triển chồi nách: Chồi nách có thể được cảm ứng phát triển in vitro bằng làm tăng sự phát triển của những chồi đang hiện có. Một mẫu cấy mang một chồi đơn sẽ phát triển thành một chồi hay một cụm chồi tùy thuộc vào loài và môi trường nuôi cấy. Chồi nách sẽ được hình thành trên chồi ban đầu, qua những lần cấy chuyển quá trình này sẽ được lặp lại một cách chính xác.
- Sự phát triển chồi bất định: Chồi bất định và những chồi có liên quan là những cấu trúc có nguồn gốc từ những vùng không phải là trục lá và hoặc chồi ngọn. Chồi bất định có thể có nguồn gốc từ thân, rễ, lá. Chồi bất định có thể có nguồn gốc từ callus và callus được coi là thể trung gian giữa mẫu cấy và cây con.
Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi như:
- Bổ sung tổ hợp phytohormone mới (tăng cytokinin giảm auxin). Tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi.
- Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1.000 lux. Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng. Ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phân hóa mạnh. Ánh sáng đỏ có ảnh hưởng giống cytokinin (cytokinin-like effect), nó tạo nên sự tích lũy cytokinin trong mô của một số loài, chính lượng cytokinin này đã góp phần kích thích quá trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ những mô nuôi cấy in vitro.
- Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20-30oC. Trường hợp những loài có nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào khoảng từ 32-35oC. Ngược lại, đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo cụm chồi phải < 30oC.
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích.