3. PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐƠN BỘI INVITRO
3.3. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn
3.3.1. Kiểu gen của cây cho bao phấn
Tần số tạo cây đơn bội liên quan chặt chẽ đến kiểu gen và thay đổi theo các chi, các loài và giữa các loài phụ, giữa các giống. Ở lúa mì, tần số cảm ứng của callus hạt phấn và sự tạo thành cây xanh tiếp sau đó được điều khiển bởi nhiều gen . Mỗi kiểu gen khác nhau tương ứng với phản ứng sinh sản đơn tính khác nhau trong nuôi cấy bao phấn. Vì thế, đây là vấn đề cần lưu ý để chọn lọc chỉ các kiểu gen có phản ứng cao , còn hơn là tập trung chú ý đến việc cải thiện các điều kiện cho hệ thống nuôi cấy (một vấn đề phức tạp) trong nuôi cấy bao phấn.
Kết quả nuôi cấy bao phấn thuốc lá N.langsdorfii thường thấp hơn khi so sánh với những loài khác thuộc cùng một chi (Durr và Fleck, 1980). Tỷ lệ hình thành phôi khác nhau rõ rệtgiữa các giống thuốc lá thuộc loài N. tabacum khi chúng được xử lý ở
14oC trong 5 ngày. Ở lúa, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn của những giống thuộc loài phụ Indica là dễ dàng hơn các giống của loài phụ Japonica. Sự khác nhau đó có thể do mỗi kiểu gen cần một tập hợp những điều kiện tối ưu cho quá trình tạo mô sẹo và phát sinh phôi.
Picard và De Buyser (1977) kết luận rằng, bao phấn của cây lúa mì đơn bội kép cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao gấp 3-10 lần cây lúa mì bình thường.
3.3.2. Nhân tố thành bao phấn
Hạt phấn của một giống thuốc lá sẽ phát triển thành phôi ngay cả khi chuyển vào bao phấn của một giống khác . Chính kết quả này đã đưa ra khái niệm “nhân tố thành” (wall factor ) và nó giúp đỡ cho nhiều nhà nghiên cứu sử dụng “hiệu ứng bảo mẫu” (nursing effect) của bao phấn ho àn chỉnh để phát triển sinh sản đơn tính ở các hạt phấn phân lập của nhiều loài . Dịch chiết của bao phấn cũng có tác dụng kích thích sản xuất phôi hạt phấn (pollen-embryo production).
Các nghiên cứu về mô học (histology) đã xác định vai trò của nhân tố thành bao phấn trong việc phát triển phôi hạt phấn.
Một số kết quả nghiên cứu cho thấy glutamine riêng rẽ hoặc phối hợp với serine và myo-inositol có thể thay thế nhân tố thành bao phấn trong các thí nghiệm nuôi cấy hạt phấn phân lập.
3.3.3. Môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng . Sinh sản đơn tính tiểu bào tử ở Nicotiana tabacum và Datura innoxia có thể được cảm ứng trên môi trường agar đơn giản chỉ chứa sucrose . Hạt phấn tiếp tục phát triển trên môi trường như thế cho đến giai đoạn hình cầu (globular stage).
Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối
khoáng vào môi trường. Tuy nhiên, hầu hết các loài thuộc họ Solanaceae chỉ phát triển sinh sản đơn tính trên môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete nutrient medium) bao gồm các loại muối khoáng , vitamin và sucrose của Nitsch hoặc MS . Muối Fe (40 µmol/L Fe-EDTA hoặc Fe-EDDHA) dường như quyết định chủ yếu cho sự phát triển phôi của hạt phấn 3 hoặc 4 tuần tuổi trong quá trình nuôi cấy.
Ở các loài không thuộc họ Solanaceae, thành phần môi trường bao gồm : các chất điều khiển sinh trưởng và các hỗn hợp dinh dưỡng phức tạp (như dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein , nuớc dừa). Môi trường của một số tác giả Trung Quốc như Chu (N6) và Yu-Pei (Bảng 5.1) dùng cho nuôi cấy bao phấn ngô . Môi trường N6 sau đó cũng được sử dụng cho nuôi cấy bao phấn của các loại ngũ cốc khác như lúa , lúa mạch đen . Trong khi nhiều loà i cần có auxin và /hoặc cytokinin để cảm ứng sinh sản đơn tính thì đa số các loài thuộc họ Solanaceae chỉ cần môi trường cơ bản.
Sucrose là một thành phần không thể thay thế của môi trường , thông thường người ta sử dụng ở n ồng độ 2-4% nhưng các loài như Brassica cần nồng độ cao hơn (10%). Thay thế sucrose bằng cách bổ sung glutathione , ascorbic acid và glucose cũng có tác dụng tương tự , kích thích sinh sản đơn tính ở lúa mạch đen . Bổ sung than hoạt tính hoặc 2-chloroethyl-phosphate vào môi trường nuôi cấy cũng có tác dụng kích thích sinh sản đơn tính ở một số hệ thống nuôi cấy.
Các nguồn chất hữu cơ không xác định như dịch chiết khoai tây,cà chua, dịch chiết nấm men,… và các amino acid, glutamine có tác động tích cực đối với sinh trưởng trong nuôi cấy bao phấn của nhiều loài thực vật. Môi trường nuôi cấy được đưa
vào 100 g dịch chiết khoai tây đã cho kết quả khá tốt trong nuôi cấy bao phấn của thuốc lá, lúa và lúa mì (Anonymuos, 1976,1977). Myo-inosytol (5 g/L) có ảnh hưởng tích cực trong phát sinh phôi hạt phấn ở nhiều thành viên họ cà.
Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi vô tính cũng như thúc đẩy sự khởi đầu của phôi từ mô bao phấn đơn bội. Hiệu quả tích cực của than đã được chứng minh trong nuôi cấy bao phấn của thuốc lá (Anagnostakis, 1974); Bajaj, Reinert và Heberle, 1977), lúa mạch đen (Wenzel, Hoffmann và Thomas, 1977), và các thực vật khác.
Bảng 5.1. Môi trường Yu-Pei
Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) MgSO4.7H2O KH2PO4 KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O KI 370 510 2500 165 176 1,6 4,4 1,5 0,8 FeSO4.7H2O Na2EDTA Sucrose Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl Nicotinic acid 2,4-D Agar/agarose 27,8 37,3 50 g 1,0 0,5 0,5 2,0 10 g
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng
Gây shock nhiệt sẽ tăng tần số sinh sản đơn tính tiểu bào tử . Các nụ được xử lý lạnh ở 3oC hoặc 5o
C/72 giờ kích thích hạt phấn phát triển thành phôi (xấp xỉ 58%) ở một số loài thuộc họ Solanaceae (Datura, Nicotiana), ngược lại bao phấn được duy trì ở 22oC trong cùng thời gian chỉ cho khả năng phát triển phôi khoảng 21%. Nói chung, gây shock nhiệt từ 2-5o
C/72 có tác dụng kích thích sự phát triển khô ng bình thường của giao tử đực và tích lũy hạt phấn đơn nhân (ức chế sự phát triển tiếp ở các giai đoạn sau).
Cụm hoa hình chùy (panicles) được tách rời của lúa khi xử lý ở 13o
C/10-14 ngày cho tần số hạt phấn tạo callus cao nhất. Cảm ứng sinh sản đơn tính sẽ có hiệu quả cao nếu bao phấn của các loại ngũ cốc khác (lúa, ngô, pennisetum) được bảo quản ở nhiệt độ thấp trước khi nuôi cấy . Một số kết quả nghiên cứu cho thấy tiền xử lý bao phấn ở nhiệt độ 35o
C đã kích thích sinh sản đơn tính ở một số loài Brassica và Capsicum.
Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng , mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối.
Tuy nhiên, các hạt phấn phân lập dường như mẫn cảm với ánh sáng hơn so với bao phấn . Ánh sáng trắng cưòng độ thấp (low intensity white light) hoặc ánh sáng
huỳnh quang đỏ (red fluorescent light) kích thích phát triển nhanh hơn của phôi trong nuôi cấy hạt phấn thuốc lá phân lập so với với ánh sáng trắng cường độ cao.
3.3.5. Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn
Bao phấn tách từ cây sinh trưởng trong điều kiện ngày ngắn (8 giờ/ngày) và ở vùng có cường độ ánh sáng cao cho phản ứng tương đối tốt hơn so với cây dài ngày (16 giờ/ngày) có cùng cường độ chiếu sáng. Sự phát sinh phôi hạt phấn có thể được cải thiện nhiều hơn nếu nhiệt độ dưới điều kiện ngày ngắn duy trì ở 18o
C.
Sự thay đổi mùa vụ thích hợp và tuổi cây cho bao phấn ảnh hưởng lớn đến phản ứng của các hạt phấn . Xử lý cây bằng cách b ơm thuốc trừ sâu hoặc các chất độc khác cần phải được tránh. Cây thiếu nitrogen có thể ảnh hưởng xấu đến bao phấn hơn so với cây được cung cấp đủ nitrogen.
Vì thế, có thể khuyến cáo rằng chỉ có những nguyên liệu sinh trưở ng ở các điều kiện môi trường được điều chỉnh tốt chẳng hạn như nhà kính (greenhouse) mới có thể dùng cho việc sinh sản đơn tính tiểu bào tử.