3. NUÔI CẤY PROTOPLAST
3.3. Tái sinh cây từ protoplast
Tính đặc trưng cơ bản của tế bào là tính toàn năng của tế bào, vì vậy protoplast có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp.
Sự tái sinh protoplast thành cây có ý nghĩa cao hơn nhiều so với sự tái sinh cây từ mô phân sinh, đoạn thân hay mô lá… trong nuôi cấy mô thông thường.
3.3.1. Tạo vách (thành) tế bào
Protoplast sau khi nuôi cấy thường có biểu hiện tăng thể tích tế bào chất, tăng kích thước và phát sinh hầu hết các bào quan (chủ yếu là lục lạp) tụ thành đám quanh nhân.
Quá trình hình thành vách (thành) tế bào có thể hoàn chỉ nh trong vòng 2 đến 7 ngày mặc dù các protoplast trong nuôi cấy thường bắt đầu tái sinh vách tế bào ngay sau khi phân lập một vài giờ . Thành tế bào vừa được tạo thành, sẽ xuất hiện các vi sợi (microfibrils) gắn kết một cách lỏng lẽo các tế bào đứng cạnh nhau, quá trình này đòi hỏi cung cấp nguồn carbon (sucrose) trong môi trường dinh dưỡng.
Các chất phân ly ion để ổn định thẩm thấu trong môi trường đã ngăn cản sự phát triển thành tế bào. Các protoplast phát triển thành tế bào kém thường phân chia tế bào cũng rất kém.
Tỷ lệ tái tạo và độ thành thục của thành tế bào trong quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Giai đoạn phân hóa của tế bào dùng làm nguyên liệu phân lập protoplast - Phương pháp phân lập protoplast
- Tính đặc thù của loài thực vật.
3.3.2. Phát triển callus và tạo cây hoàn chỉnh
Ngay sau khi tạo thành tế bào chung quanh protoplast , các tế bào được tái cấu trúc đã tăng kích thước và sau 3-5 ngày xuất hiện sự phân chia tế bào đầu tiên.
Sau 1-3 tuần nuôi cấy, các microcallus được tạo thành và có thể cấy chuyển chúng sang môi trường không có sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu (osmotic-free) để tạo macrocallus. Các macrocallus này được cảm ứng để phân hóa cơ quan , hoặc tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Quá trình phân chia của protoplast để hình thành callus phụ thuộc vào: - Thành phần môi trường nuôi cấy
- Loại, nồng độ và tỷ lệ auxin/cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy - Điều kiện nuôi cấy
Hình 6.5. Sự phân chia tiếp theo của protoplasts Echinacea purpurea A. Phân chia protoplast - sau 6 giây
B,C. Sự phân chia thứ 2 và thứ 3 của protoplast D. Cụm Protoplast - nhận được sau 6 ngày nuôi cấy
Trong quá trình tái sinh protoplast thành khối callus có thể quan sát thấy một số biến dị như các protoplast chứa nhiều nhân.
Những thể đa nhân này được hình thành là do sự phân chia không hoàn toàn của tế bào chất trong đó có cả sự dung hợp tự phát. Những protoplast đa nhân này thường không phát triển được.
Tuy nhiên, trong rất ít trường hợp nó có thể phát triển thành cây đa nhân. Trong nhiều trường hợp có thể phát sinh phôi và cơ quan phân hóa tạo cây đa bội.
Kể từ khi các loài thuộc họ Solanaceae được phân lập và tái sinh cây thành công đầu tiên ở cây thuốc lá (Takebe 1971), đến nay người ta đã thành công ở nhiều họ khác nhau như các loài legume , các cây trồng ăn quả và lấy sợi (fibre and pulp crops), các loài cây gỗ, và thậm chí các loài ngũ cốc như pennisetum, lúa và lúa mì.
Hình 6.6. Tạo mô sẹo, Tái sinh cây và sự phát triển của cây con từ protoplasts của Echinacea purpurea.
A. Tạo callus từ cụm protoplast thu nhận được B. Sự phát sinh cơ quan từ callus
C.Tái sinh chồi từ callus D. Cây con hoàn chỉnh
3.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của protoplast
a. Độ tinh sạch của protoplast sau khi phân lập
Protoplast sau khi phân lập sẽ được nuôi trên môi trường cùng với các mảnh vỡ tế bào và các cặn bã. Để nâng cao hiệu quả nuôi cấy, cần phải thanh lọc protoplast trong hỗn hợp này. Có một số phương pháp thanh lọc được áp dụng, sau đây là 2 phương pháp được sử dụng phổ biến nhất:
- Phương pháp kết lắng và rửa sạch: protoplast ngay sau khi phân lập sẽ được ly tâm ở tốc độ thấp trong thời gian ngắn. Phương pháp này làm cho protoplast nguyên vẹn sẽ kết tủa, các mảnh vỡ và các tế bào đứt gãy sẽ lơ lửng ở phần dịch bên trên. Thu lấy phần kết tủa (chứa protoplast) và hòa tan thành dạng huyền phù bằng môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất gây áp suất thẩm thấu.
- Phương pháp nổi: dung dịch tráng có chứa mannitol, sorbitol, saccharose (0,3-0,6M) là dung dịch có tác dụng gây nổi protoplast vì chúng tạo ra sự chênh lệch về tỷ trọng giữa protoplast nguyên vẹn và mảnh vỡ tế bào. Có thể ly tâm để tách các phần này ra khỏi nhau. Dùng pipette nhẹ nhàng hút phần dịch nổi phía trên có chứa
protoplast. Phương pháp này có hiệu quả hơn phương pháp trên do ít làm vỡ protoplast hơn.
b. Sức sống của protoplast
Về nguyên lý, để kiểm tra sức sống của protoplast có thể dựa vào các cơ sở sau: - Xác định sự tồn tại của nguyên sinh chất
- Các phương pháp nhuộm màu
- Xác định khả năng thay đổi kích thước của protoplast khi thay đổi áp suất thẩm thấu môi trường nuôi cấy
- Hoạt động quang hợp và hô hấp của protoplast.
Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng các chất nhuộm màu:
- Chất FDA (chất nhuộm huỳnh quang): chất này khi bám vào màng nguyên sinh chất sẽ làm cho các protoplast có màu xanh, nếu protoplast không còn sức sống sẽ có màu trắng.
- Chất phenosafranin (0,1%): sau 2 giờ trong dung dịch nhuộm, protoplast còn sống sẽ không bắt màu, protoplast đã chết sẽ có màu đỏ.
- Chất CPW (calcofluan white – 0,1%): chất này dùng để kiểm tra sự hình thành vách tế bào. Protoplast còn sống sẽ có một vòng huỳnh quang quanh màng sinh chất, protoplast đã chết không có đặc điểm này.
c. Mật độ protoplast
Mật độ protoplast là điều kiện đầu tiên rất cần thiết cho quá trình nuôi cấy protoplast vì trong quá trình nuôi cấy, nếu như mật độ không thích hợp sẽ ức chế quá trình tái tạo thành tế bào và sự phân chia tạo callus.
Mật độ protoplast tối ưu là từ 1 × 104 đến 1 × 105 protoplast/ml. Ví dụ: đối với protoplast thuốc lá, mật độ nuôi trong hộp petri là 5 × 104
protoplast/ml, dưới 10% số lượng này thì protoplast sẽ không phân chia (Evans và Cocking, 1977) các thí nghiệm lai soma (somatic hybridization ) và phát sinh đột biến (mutagenesis) cần tạo dòng tế bào riêng rẽ , do đó phải dàn trải protoplast ở mật độ thấp hơn (100 - 500 protoplast/ml).
Nuôi cấy ở mật độ thấp giúp dễ dàng phân lập và xác định các khuẩn lạc lai khi có mặt của hệ thống chọn lọc . Số lượng protoplast được xác định bằng buồng đếm hồng cầu.
Môi trường KM 8p kích thích phân chia nhanh hơn ở các protoplast thịt lá của cỏ linh lăng (alfalfa), đậu (pea), khoai tây và sản phẩm dung hợp potato + tomato được nuôi cấy dàn trải ở mật độ thấp.
Các protoplast nuôi cấy trên môi trường này được đặt trong tối vì môi trường KM 8p sẽ trở nên độc đối với tế bào dưới điều kiện ánh sáng mạnh.