- Phương pháp mẫn cảm dược phẩm
Có thể ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của các protoplast phân lập từ các loài khác nhau.
Hình 6.10. Sơ đồ chọn lọc các thể lai soma bằng cách ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của các protoplast thịt lá đối với actinomycin D
Ví dụ: Petunia hybrida và P. Parodii đối với actinomycin D . Trên môi trường MS, các protoplast tế bào thịt lá của của P. hybrida phát triển mạnh tạo thành khối callus lớn (macroscopic callus) trong khi ở P. parodii các protoplast chỉ tạo thành các khuẩn lạc tế bào nhỏ. Bổ sung actinomycin D vào môi trường nuôi cấy có hiệu quả đối với khả năng tái sinh của protoplast P. parodii, nhưng ở P. hybrida các protoplast lại mất khả năng phân chia . Mặc dù môi trường nuôi có bổ sung dược phẩm , các thể dị nhân vẫn có thể sinh trưởng và sau cùng phân hóa thành các cây lai soma . Chọn lọc thể lai soma giữa N. sylvestris và N. knightiana cũng theo phương pháp tương tự.
- Các đột biến khuyết dưỡng
Chọn lọc các thể lai soma nhờ sự bổ sung di truyền của các đột biến khuyết dưỡng (auxotrophic mutants), phương pháp này chỉ thích hợp khi các dòng lai được mong đợi sống sót trên môi trường cơ bản . Mặc dù phương pháp này ứng dụng cho các thực vật bậc cao có gặp một số khó khăn , nhưng người ta cũng đã thành công trong việc chọn lọc một số lượng lớn các thể lai soma bằng cách dùng các protoplast khuyết tật enzyme nitrate-reductase (không sử dụng nitrate) và các dòng đột biến thuốc lá kháng chlorate. Các protoplast của hai đột biến khác nhau này đã được dung hợp và nuôi cấy trên môi trường chứa nitrate (nguồn nitrogen chính ). Trong thí nghiệm đối chứng các pro toplast bố mẹ không sinh trưởng khi có mặt nitrate trong khi các sản phẩm dung hợp đã tái sinh cây.
- Chọn lọc bổ sung di truyền
Dùng phương thức chọn lọc bằng mắt để phân lập các tế bào lai phát triển trên môi trường nuôi cấy có thành phần gây mẫn cảm đối với các protoplast bố mẹ.
Thí nghiệm điển hình là dùng protoplast dạng hoang dại (mô thịt lá ) của
Petunia parodii dung hợp với protoplast bạch tạng phân lập từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của P. hybrida, P. inflata và P. parviflora trong các thí nghiệm riêng rẽ.
Ở trong tất cả các tổ hợp này protoplast màu xanh của P. parodii bị đào thải ở giai đoạn khuẩn lạc có kích thước nhỏ , trong khi các protoplast của các loại bố mẹ khác phát triển thành các khuẩn lạc không màu.
Ngược lại, các thể lai sinh sản thành các callus màu xanh và sau đó thành cây lai soma. Phương thức này cũng dùng để lai soma khác loài ở các chi Daucus, Datura và các chi
khác.
Tuy nhiên , trong các thí nghiệm lai soma khác chi , người ta đã dùng phương thức trong đó các protoplast bố mẹ và các thể lai dị nhân được phép phát triển callus trong nuôi cấy.
Kết quả tạo ra ba loại callus khác nhau về hình thái, và có thể xác định được các mô lai, là các mô sau đó được phân lập ra để tái sinh thành cây lai soma.
Hình 6.12. Phương thức dùng cho lai soma khác chi của Atropa belladonna
- Sử dụng các đột biến bạch tạng có các gen không allele cho chọn lọc bổ sung di truyền
Melchers và Labib (1974) đã tiến hành thí nghiệm bằng cá ch sử dụng protopplast của hai giống thuốc lá Nicotiana tabacum: Giống s (sublethal) không tổng hợp được diệp lục bình thường nên rất mẫn cảm với ánh sáng cường độ cao . Giống v
(virescent) cũng không tạo được lục lạp bình thườ ng lá non trắng hoàn toàn và mẫn cảm với ánh sáng cường độ cao.
Hai giống này là hai dạng đột biến có thể bổ sung cho nhau được khi lai tạo , nghĩa là nuôi cấy ở ánh sáng 800 lux tới giai đoạn ra hoa, sau đó cho thụ phấn chéo sẽ thu được cây lai F1có lá xanh bình thường và chịu ánh sáng cao (10.000 lux).
Melchers đã tiến hành tách protoplast của cây đơn bội thu được từ nuôi cấy bao phấn của cây s và cây v rồi cho dung hợp . Sản phẩm dung hợp được chọn lọc trên môi trường chiếu 10.000 lux cho kết quả chỉ những hợp bào sống và phát triển thành khối callus xanh, trong khi các loại tế bào bố mẹ đều chết . Cây tái sinh từ khối callus xanh có lá xanh bình thường và chịu được ánh sáng cường độ cao.
Thành công của Melchers là đã sử dụng hai đột biến bổ sung và chứng minh được sản phẩm dung hợp mang gen bổ sung đó.
- Cây lai pomato
Kết quả nổi bật của Melcher trong lai protoplast giữa cà chua và khoai tây đán h dấu một mốc quan trọng trong lĩnh vực này.
Cây lai cà chua và khoai tây đầu tiên ra đời năm 1977, khi lai protoplast của cây cà chua [Lycopersicum esculentum Mill/var. cerasiforme (Dunal) Alef. (đột biến xanh vàng 6 Rick)] với protoplas t tế bào callus nuôi trong dịch lỏng của dòng khoai tây lưỡng bội DH số HH 258.
Sản phẩm dung hợp lúc đầu chỉ tái sinh rễ về sau thu được chồi nhưng không phân biệt được chồi cây lai hay chồi khoai tây có màu lá bất thường . Phân tích nhiễm sắc thể không kết quả vì nhiễm sắc thể khoai tây và cà chua rất khó phân biệt hình dạng.
Biện pháp của Holdn là giữa cà chua và khoai tây có sai khác nhau về băng protein của enzyme ribulose -1,5-biphosphat carboxylase trên điện di SDS (sodium dodecyl sulfate) từ đó mà Melchers phân biệt được sản phẩm dung hợp với tế bào bố mẹ.
Các dạng cây lai được phát hiện:
- Dạng 1: Cây lai có plastome (hệ gen lục lạp) khoai tây. - Dạng 2: Cây lai có plastome cà chua.
Dạng 1 (potato + tomato) có plastome của potato được gọi là pomatoes. Dạng 2 (potato + tomato) nhưng có plastome của tomato được gọi là topatoes. Trong hai dạng này một số có khả năng tạo bộ phận giống củ nhưng hoa vẫn bất thụ. Vấn đề này đang được nghiên cứu , hy vọng sẽ tạo ra được cây rau có quả cà chua và củ khoai tây.