2. THỤ PHẤN INVITRO
2.2. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn invitr o
2.2.1. Trạng thái sinh lý của mẫu vật
Trạng thái sinh lý của nhụy ở thời điểm tách rời noãn ảnh hưởng đến sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro. Bề mặt noãn hoặc núm nhụy (trong thụ phấn núm nhụy) ẩm ướt có thể ảnh hưởng xấu đến nảy mầm của hạt phấn hoặc phát triển của ống phấn và tiếp theo đó là hình thành hạt kém . Sự nảy mầm của hạt phấn trên núm nhụy và sự sinh trưởng của ống phấn dọc theo vòi nhụy có ảnh hưởng đến sự tổng hợp các protein, là các nhân tố đôi khi có thể ức chế hoàn toàn ống phấn trong bầu quả . Do đó, cần phải xác định bộ phận nào của nhụy tồn tại hàng rào ngăn cản.
Để cải thiện khả năng thụ phấn in vitro, mức độ bất hợp phải được giảm xuống bằng cách tách bộ phận tổng hợp các protein ức chế và thụ phấn trực tiếp phần còn lại của nhụy dưới các điều kiện thí nghiệm.
Thời gian tách noãn khỏi nhụy ảnh hưởng đến sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro. Các noãn được tách ra sau khi nở hoa từ 1-2 ngày cho khả năng hình thành hạt cao hơn khi tách noãn vào ngày ra hoa . Ở ngô và bông, thụ phấn in vitro sau
khi xuất hiện râu tơ từ 3-4 ngày cho kết quả tạo hạt tốt hơn.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển bình thường của bầu quả và noãn trong nuôi cấy cho tới khi tạo hạt . Maheshwari (1958) đã nuôi cấy thành công noãn trên môi trường dinh dưỡng bao gồm muối khoáng theo Nitsch, vitamin theo White (xem bảng 4.1), và 5% saccharose. Noãn của Papaver rhoeas và P. somniferum được tách 6 ngày sau khi thụ phấn (DAP- days after pollination) và thu được hợp tử hoặc tiền phôi có hai tế bà o (two-celled proembryo) chứa một vài nhân nội nhũ (endosperm nuclei).
Sinh trưởng của phôi ở giai đoạn đầu thấp hơn nhưng ngay sau đó ở giai đoạn hình cầu sinh trưởng nhanh hơn và đạt kích thước 0,93 mm so với 0,65 mm của phôi
in vivo. Bổ sung kinetin và CH là cần thiết để kích thích sinh trưởng ban đầu của phôi . Một số noãn của hoa lan (orchids) được phân lập từ các bầu quả đã thụ phấn sinh trưởng tốt trên dung dịch đơn giản có saccharose 10%, nhưng noãn của Zephyranthes
(mang một hợp tử và một nhân nội nhũ sơ cấp ) cần bổ sung nước dừa hoặc casamino acid vào môi trường Nitsch . Ở Trifolium repens, noãn (1-2 DAP) phát triển thành hạt trưởng thành chỉ khi môi trường nuôi cấy được b ổ sung dịch chiết các loại quả non như dưa chuột hoặc dưa hấu.
Trong nuôi cấy in vitro các noãn đã được thụ phấn ở hầu hết các loài thì môi trường Nitsch có cải biến (Bảng 4.1) được sử dụng rộng rãi . Tuy nhiên, môi trường Steward và Hsu (S-H) thích hợp hơn cho nuôi cấy các thể lai cùng loài hoặc khác loài sau khi thụ tinh các noãn non (Bảng 4.2). Môi trường nuôi cấy chứa IAA 10 µg/L hoặc kinetin 0,1 µg/L làm tăng số lượng hạt được tạo thành từ noã n. Nồng độ cao hơn của kinetin thường gây ức chế . Nguồn nitrogen (hỗn hợp các amino acid hoàn chỉnh ) không ảnh hưởng đến tần số thụ tinh của các bầu quả của ngô được thụ phấn in vitro,
nhưng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển tối thích của hạt (Bảng 4.3).
Áp lực thẩm thấu của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của noãn tách rời. Nói chung, noãn chứa các phôi hình cầu phát triển thành hạt trưởng thành trên môi trường chứa saccharose từ 4-10%, nhưng các noãn non đã được thụ tinh có một hợp tử và một vài nhân nội nhũ , hoặc các noãn vừa mới thụ tinh cần 6% và 8% saccharose, tương ứng.
2.2.3. Điều kiện nuôi cấy
Nói chung, nhiệt độ và ánh sáng có ản h hưởng đến quá trình thụ tinh trong ống nghiệm. Thông thường bước một của quá trình này xảy ra ở nhiệt độ phòng và không cần sự chiếu sáng đặc biệt . Chỉ ở giai đoạn sau , nuôi cấy bầu quả cần được duy trì ở 22-26oC và các điều kiện thích hợp khác có lợi cho phát sinh phôi.
Sau khi thụ phấn trong ống nghiệm một vài ngày , một số noãn mở rộng, và ống phấn chui hoàn toàn vào trong túi phôi , cả phôi lẫn nội nhũ đều phát triển . Hiện tượng này có thể xác minh bằng các thí nghiệm tế bào-phôi học (cytoembryology).
2.2.4. Kiểu gen
Phản ứng của bầu quả in vitro trong mối liên quan với sự hình thành hạt tùy thuộc vào từng loài . Hạt phấn của các loài họ cải khó nảy mầm trong nuôi cấy và người ta phải cải tiến kỹ thuật nuôi cấy cho phù hợp bằng cách nhúng noãn của
Brassica oleracea trong dung dịch CaCl2 1%, sau đó gieo chúng trên một lớp gelatin 10% mỏng (10 µm) rồi thụ phấn với hạt phấn.
Lớp gelatin mỏng được bảo quản trong đĩa petri có phủ giấy lọc gắn vào nắp hộp. Sau 24 giờ nuôi, noãn được thụ tinh và chuyển lên môi trường Nitsch có agar cho tới khi tạo hạt.
Bảng 4.1. Môi trường Nitsch-sử dụng phổ biến trong nuôi cấy các noãn thụ phấn in
vitro Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) CaNO3 500 FeC6O5H7.5H2 O 10 KNO3 125 Glycine 7,5 KH2PO4 125 Ca- pantothenate 0,25
Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) MgSO4.7H2O 125 Pyridoxine HCl 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 Thiamine HCl 0,25 Na2MoO4 0,025 Niacin 1,25 ZnSO4.7H2O 0,5 Saccharose 50000 MnSO4.4H2O 3 Agar 7000 H3BO3 0,5
Bảng 4.2. Môi trường Steward và Hsu (S-H)-nuôi cấy các thể lai cùng loài và khác loài từ các noãn non được thụ tinh
Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) KNO3 5055 KI 8,6 NH4NO3 1200 MnSO4.4H2O 0,83 KH2PO4 272 H3BO3 16,9
MgSO4.7H2O 493 Acid nicotinic 6,18
CaCl2.2H2O 441 Pyridoxine HCl 0,49 FeSO4.7H2O 8,3 Thiamine HCl 0,82 Na2-EDTA 11 Inositol 1,35 CuSO4.5H2O 0,025 D-Fructose 180 CoCl2.6H2O 0,024 Saccharose 3600 Na2MoO4.2H2O 0,24 IAA 40000 ZnSO4.7H2O 5 × 10-5 mol/L
Bảng 4.3. Môi trường Gengenbach có hỗn hợp các amino acid hoàn chỉnh-cần thiết cho sinh trưởng và phát triển tối thích của hạt ngô
Thành phần Nồng độ Thành phần Nồng độ KH2PO4 3750* Threonine 198** MgCl2.6H2O 1500* Serine 347** CaCl2.2H2O 1200* Glutamate 1761** CuSO4.5H2O 0,1* Proline 621** CoCl2.6H2O 0,1* Alanine 476** Fe-EDTA 50* Cystein 160** Na2MoO4.2H2O 1* Valine 330**
Thành phần Nồng độ Thành phần Nồng độ ZnSO4.7H2O 10* Methionine 117** KI 5* Isoleucine 237** MnSO4.4H2O 100* Leucine 1009** H3BO3 100* Tyrosine 262** Glycine 168** Phenylalanine 387** Thiamine HCl 0,4** Lysine 88**
Acid folic 0,044** Histidine 164**
Niacin 1,2** Arginine 150** Saccharose 150*** Asparagine 300** IAA Glutamine 292** Agar 5,5*** Tryptophan 204** Aspartate 500** Chú thích: * : µM, ** : mg/L, *** : g/L
2.3. Ứng dụng của thụ phấn in vitro
Được ứng dụng ít nhất ở 3 lĩnh vực : ( a) vượt qua sự tự bất hợp (self- incompability), (b) vượt qua sự bất hợp khi lai (cross-incompability) của các giao tử và (c) sản xuất thể đơn bội thông qua trinh sản (parthenogenesis).
Các loài Petunia axillaris và P. hybrida là tự bất hợp . Hạt phấn nảy mầm tốt trên nhụy được tự thụ phấn nhưng tồn tại một hàng rào ngăn cản ở trong bầu quả đã cản trở sự phát triển của ống phấn, làm cho ống phấn không thể thụ tinh với noãn . Các hàng rào trong các taxon này có thể được vượt qua bằng sự th ụ phấn in vitro và sự hình thành hạt xuất hiện bình thường. Ở loài P. axillaris tính bất hợp cũng có thể vượt qua nhờ sự thụ phấn nụ hoa in vivo (in vivo bud pollination).
Nuôi cấy thành công các noãn được thụ phấn in vitro đã tăng khả năng sản xuất các thể lai.
Lai cùng loài (intraspecific), khác loài (interspecific), khác chi (intergeneric) và khác họ (interfamilia) cũng đã được tiến hành thông qua sự thụ phấn giá noãn và noãn
in vitro. Một ứng d ụng khác của thụ phấn in vitro là sản xuất các thể đơn bội của
Mimulus luteus cv. Tigrinus grandiflorus bằng cách thụ phấn các noãn tách tời của nó với Torenia fournieri. Thể đơn bội của M. luteus phát triển bằng trinh sản . Sự phát triển bằng trinh sản như thế của các thể đơn bội trong nuôi cấy từ các noãn được thụ phấn nhưng không thụ tinh đã được thông báo ở các loài Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum và Triticum aestivum.