Những vấn đề tồn tạ i trong nuôi cấy tế bào công nghiệp có thể được giải quyết thông qua kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ , cơ sở khoa học của giải pháp này là việc nhiễm callus với giống vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes khiến cho tế bào callus đồng nhất phân hóa thành rễ. Vi khuẩn này chuyển DNA của nó vào trong bộ gen của tế bào thực vật và khiến cho những gen tạo chất điều khiển sinh trưởng của rễ hoạt động. Hệ thống rễ đa bội bào là nơi lý tưởng để sản sinh ra hóa chất thực vật và chúng rất ổn định về di truyền, sinh trưởng nhanh (từ một đầu rễ nuôi cấy rễ lông có thể tăng trọng lượng từ 2500 - 5000 lần trong 3 tuần) mang lại cho nuôi cấy tế bào khá nhiều ưu điểm trong đó đáng k ể là khả năng tránh nhiễm khuẩn . Nhìn chung rễ tơ thường được sử dụng trong các hệ thống nuôi cấy vì những lý do sau:
- Ổn định về di truyền, khả năng sản xuất các chất thứ cấp cao - Tăng trưởng nhanh, không phụ thuộc vào auxin
- Phù hợp với các hệ thống lên men.
Vì vậy, đây là một kỹ thuật dễ dàng sử dụng với quy mô công nghiệp
Các công ty Nhật Bản đã xử dụng kỹ thuật này để mở rộng nuôi cấy rễ nhân sâm, loại nuôi cấy này tỏ ra dễ điều khiển hơn.
Công ty Escagenetics (California, Mỹ) cũng đã thông báo thành công trong việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy rễ lông. Taxol là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của cây thủy tùng (Taxus brerifolia) đang được dùng thử có kết quả trong điều trị nhiều loại ung thư. Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì bản thân cây thủy tùng khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp . Escagenetics đã có thể sản xuất taxol với nồng độ cao hơn nồng độ tự nhiên thấy trong vỏ và lá cây thủy tùng.
Hiện nay, hãng Phyton Catalytic (New York, Mỹ) đã mua bản quyền sản xuất toxol hoặc chất đồng đẳng của taxol ở qui mô pilot. Giá bán taxol hiện nay được xác định là 200.000 - 300.000 USD/kg. Theo Escagenetics việc sản xuất vanillin bằng nuôi cấy tế bào công nghiệp đã là bệ phóng tốt để họ đi tới nuôi cấy tế bào taxol. Thông qua mối quan tâm về sản xuất taxol hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp dược chất được mở rộng. Tới nay mới có 10 trong số các dược chất có nguồn gốc thực vật đang được xử dụng rộng rãi (khoảng 300.000 loài) được tổng hợp nhân tạo trong phòng thí nghiệm, số còn lại đều được chiết trực tiếp từ cây cỏ . Thế nhưng mới đây Văn phòng thương mại và bản quyền Mỹ đã cấp quyền tác giả cho ĐH Quốc gia Florida về qui
trình công nghệ bán tổng hợp thuốc chống ung thư . Công nghệ này kết hợp một chất gọi là baccatin III và một chuỗi tổng hợp để thu được một chất có cấ u trúc giống chất taxol tự nhiên. Baccatin III được tách chiết từ thủy tùng nước Anh , họ hàng với thủy tùng Địa Trung Hải . Công ty dược Bristol -Myers Squibb, nơi cung cấp taxol tự nhiên chính vừa ký hợp đồng bản quyền với ĐH Quốc gia Florida để đưa công nghệ sản xuất taxol vào sản xuất.
Srinivasan và cs. (1997) đã nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của 2 loài thuỷ tùng là Taxus chinensis và T. baccata trong hệ thống nuôi cấy mô hình (model system ) nhằm chứng minh khả năng tương tự trong tích lũy sinh khối (biomass) và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp (taxane) thu từ nuôi cấy trong các đĩa polystyrene 6 ngăn (six-well polystyrene plates ) và các bình thủy tinh (loại 25 ml và 125 ml, lắc 120 vòng/phút).
Merkli và cs . (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum với sự gây nhiễm chủng A 4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợ p (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040% trọng lượng khô (trên môi trường nuôi cây thích hợp nhất -McCown’s woody plant medium có 1% saccharose) gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A 4 8 tháng tuổi (0,024%). Các tác giả này cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol , pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin . Bổ sung 40 mg/l chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ nâng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng.
Sevón và cs . ( 1997) đã tái sinh cây từ protoplast của rễ cây Hyoscyamus muticus được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes và sau đó phân tích hóa học trên 34 cây riêng rẽ đã trưởng thành . Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây này có sản xuất hyoscyamine, scopolamine, và nhiều loại calystegin , và điều đáng kể là đã tìm thấy các biến dị dòng soma trong các cây này . Tuy nhiên, sự có mặt của các gen rol (A, B
và C) của A. rhizogenes gây bất lợi cho việc tích lũy các alkaloid trong các cây chuyển gen ngược lại với ưu điểm của nuôi cấy rễ tơ.
Sikuli và cs. (1997), đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy đến sự tích lũy sinh khối và sản lượ ng alkaloid của rễ tơ thu được sau khi gây nhiễm cây Datura stramonium với chủng Agrobacterium ATCC 15834. Hàm lượng hyoscimine ở rễ đạt cực đại sau 6 tuần nuôi cấy khoảng 100mg/l. Bên cạnh đó, các tác giả này còn nghiên cứu ảnh hưở ng của sự cân bằng ion ( -
3 NO , 2- 4 SO , - 4 2PO H , K+, Ca2+ và Mg2+) đến sản lượng sinh khối và sự tích lũy hyoscyamine . Nồng độ -
3
NO và K+ cao cho sinh khối cao nhất, còn sản lượng hyoscyanine cao nhất khi 2-
4
SO và K+ cao.
TÓM TẮT CHƯƠNG
Thực vật cung cấp các sản phẩm thứ cấp gồm ba nhóm chính: alkaloid, tinh dầu, glycoside.
Các kỹ thuật nuôi cấy nhằm kích thích sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy:
+ Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy + Cung cấp tiền chất
+ Kích kháng bảo vệ thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy rễ lông tơ nhằm thu các hợp chất thứ cấp.
CÂU HỎI
Câu 1: Hãy phân tích vai trò của kỹ thuật nuôi cấy mô trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp.
Câu 2: Hãy trình bày chiến lược sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.
Câu 3: Hãy phân tích những vấn đề có thể gặp trong sản xuất hợp chất bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1]. Nguyễn Hoàng Bách (2010). Nghiên cứu chuyển gen LTB
vào cây càng cua (Peperomia pellucida) bằng kỹ thuật vi
đạn. Luận văn thạc sĩ, Đại học Huế.
[2]. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2000), Di truyền phân tử, Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng (2). NXB Nông Nghiệp.
[3]. Trịnh Đình Đạt (2007), Công nghệ sinh học tập (4), NXB Giáo dục. Nguyễn Như Hiền (2007), Công nghệ sinh học tập (1), NXB Giáo dục.
[4]. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật
[5]. Phan Thị Á Kim (2008). Thăm dò điều kiện thích hợp để chuyển gen ltb vào cây
rau má (Centella asiatica (L.) Urban). Luận văn thạc sĩ, Đại học Huế.
[6]. Nguyễn Thị Duy Khoa (2007). Nghiên cứu phương pháp
chuyển gen cholera toxin B subunit vào cây cà chua. Luận
văn thạc sĩ, Đại học Huế.
[7]. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình Nhập môn Công nghệ sinh học, NXB Đại học Huế.
[8]. Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi (2007), Giáo trình Sinh học phân tử, NXB Đại học Huế.
[9]. Nguyễn Hoàng Lộc (2006), Giáo trình Công nghệ tế bào, NXB Đại học Huế. [10]. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2009), Giáo trình Công nghệDNA tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh .
[11]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TPHCM.
[12]. Trần Văn Minh (2001), Công nghệ sinh học thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới- Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ quốc qia.
[13]. Dương Tấn Nhật (2007), Công nghệ sinh học thực vật (1), NXB Nông Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh.
[14]. Hoàng Minh Tấn (Chủ biên), Nguyễn Quang Thạch, Vũ Quang Sáng (2006),
Sinh lý Thực vật, NXB Nông nghiệp, 193-199.
[15]. Nguyễn Quang Thạch,Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Thị Phương Thảo (2005),
Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, 53-57.
[16]. Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
[17]. Lê Thị Thính (2006). Nghiên cứu chuyển gen cholera
toxin B subunit (ctb) vào cây trồng bằng phương pháp biến
nạp Agrobacterium tumefaciens. Luận văn thạc sĩ, Đại học
Huế.
[18]. Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật (1),
NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
[19]. Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật (2),
NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
[20]. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng (2007), Công nghệ sinh học tập 2, NXB Giáo dục, 32-35.
2. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[21]. A.J.Nair, PH.D (2008), ”Introduction to Biotechnology and genetic
engineering”. Infinity Sicence press LLC, India, 681-685.
[22]. Bhojwani S.S and Razdan. MK (1996), “Plant tissue culture Theory and
Practice”, Elsevier Science B.V, Netherland.
[23]. De la Riva GA, González-Cabrera J, Vázquez-Padrón R, and Ayra-Pardo C (1998), "Agrobacterium tumefaciens: a nutural tool for plant transformation",
Electronic Journal of Biotechnology 1(3), 1-16.
[24]. Duchefa Biochemie B.V (2003-2005), “Biochemicals plant cell and tissue
culture”, Catalogue.
[25]. Edwin F. George and Michael A. Hall (2008), “Plant propagation by tissue
culture”, Sringer.
[26]. Jiang XL, He ZM, Peng ZQ, Qi Y, Qing C and Yu SY (2007), “Chorela toxin B
protein in transgenic tomato fruit induces systemic immune in mice”, Transgenic Res
16, 169-175.
[27]. Karl.H.N and Aswani. K.J (2009), “Plant cell and tissue culture- A tool in
Biotechnology”, Sringer, Verlag Berlin Heidelerg.
[28]. Lydiane Kyte and John Kleyn (2001), “Plants from test tubes-An introduction to
micropropagation”, third edtion, Timber Press, Portland, Oregon.
[29]. Murashige T and Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bio-
[30]. Peña Leandro (2004), Transgenic plants, Humana Press
[31]. Ramaxhandra R.S and Ravishankar GA (2002), “ Plant tissue culture, Chemical
factories of secondary metabolites”, Biotechology Advances, Elsevier Science,
Netherland.
[32]. Robert N.Trigino and Dennis J (2000), Plant tissue culture concepts and
Laboratory excercises second 2, CRC Press LLC, 45-29.
[33]. Sanjaya and Chan MT (2005), “Advances in Agrobacterium mediated
transformation in tomato-an overview”, Journal of Genetics and Moleculer Biology 4,
Lời nói đầu ... 1
Chương 1. GIỚI THIỆU VỀ TÍNH TOÀN THỂ CỦA TẾ BÀO ... 2
1. HỌC THUYẾT TẾ BÀO ... 2
2. TÍNH TOÀN THỂ CỦA TẾ BÀO ... 2
2.1. Tính toàn thể của tế bào ... 2
2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào ... 3
2.3. Tế bào thực vật và sự phân bào ... 4
2.4. Thể bội và gen ... 10
2.5. Thể bào tử và thể giao tửở thực vật bậc cao ... 11
TÓM TẮT CHƯƠNG ... 11
CÂU HỎI ... 12
Chương 2. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG ... 13
1. NGUỒN DINH DƯỠNG KHOÁNG VÀ CARBON ... 13
1.1. Các nguyên tố đa lượng ... 14
1.2. Các nguyên tố vi lượng ... 16
1.3. Carbon và nguồn năng lượng ... 18
2. CÁC PHỤ GIA HỮU CƠ ... 19
2.1. Các vitamin ... 19
2.2. Các acid amin ... 21
2.3. Các phụ gia hữu cơ khác ... 21
2.4. Than hoạt tính (activated charcoal-AC)... 22
2.5. Các kháng sinh (antibiotics) ... 23
3. CÁC CHẤT ĐIỀU KHIỂN SINH TRƯỞNG THỰC VẬT ... 23
3.1. Auxin (hormone sinh trưởng) ... 23
3.2. Cytokinin (hormone phân bào)... 24
3.3. Gibberellin ... 25
3.4. Abscisic acid (ABA) ... 25
4. CÁC NHÂN TỐ KHÁC ... 25
4.1. Các nhân tốlàm rắn môi trường ... 25
4.2. pH môi trường ... 26
5. MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN ... 27
CÂU HỎI ... 30
Chương 3. NHÂN GIỐNG IN VITRO THỰC VẬT ... 31
1. MỘT SỐ THUẬT NGỮ DÙNG TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO THỰC VẬT ... 31
1.1. Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem-tip culture) ... 31
1.2. Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation) ... 31
1.3. Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction) ... 31
1.4. Phát sinh cơ quan (organogenesis) ... 32
1.5. Phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis) ... 32
2. MỤC ĐÍCH CHUNG CỦA NUÔI CẤY MÔ ... 34
3. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC HỆ THỐNG NUÔI CẤY MÔ ... 34
3.1. Tái sinh cây mới từ các cấu trúc sinh dưỡng ... 35
3.2. Nhân giống thông qua giai đoạn callus ... 38
3.3. Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính-công nghệ phôi vô tính38 4. CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO ... 45
4.1. Giai đoạn I-cấy gây ... 45
4.2. Giai đoạn II-nhân nhanh ... 45
4.3. Giai đoạn III-chuẩn bịvà đưa ra ngoài đất ... 46
5. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ VIỆC SỬ DỤNG ƯU THẾ LAI ... 47
6. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM KHÔNG DI TRUYỀN ... 47
6.1. Hiện tượng các đặc điểm epigenetic không lưu lại ... 47
6.2. Hiện tượng các đặc điểm epigenetic được lưu lại ... 47
TÓM TẮT CHƯƠNG ... 48
CÂU HỎI ... 49
Chương 4. THỤ PHẤN IN VITRO VÀ NUÔI CẤY PHÔI HỮU TÍNH ... 50
1. TÍNH BẤT HỢP CỦA GIAO TỬ TRƯỚC VÀ SAU KHI THỤ TINH ... 50
1.1. Tính bất hợp của giao tửtrước khi thụ tinh ... 50
1.2. Tính bất hợp giao tử sau khi thụ tinh ... 50
2. THỤ PHẤN IN VITRO ... 50
2.1. Phương pháp học ... 52
2.2. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro . 53 2.3. Ứng dụng của thụ phấn in vitro ... 56
3. NUÔI CẤY PHÔI HỮU TÍNH ... 56
3.1. Các kiểu nuôi cấy phôi ... 57
3.2. Kỹ thuật nuôi cấy ... 58
3.3. Môi trường dinh dưỡng ... 58
3.4. Một số khó khăn trong nuôi cấy phôi ... 61
3.5. Ứng dụng của nuôi cây phối hữu tính ... 61
TÓM TẮT CHƯƠNG ... 62
CÂU HỎI ... 63
Chương 5. NUÔI CẤY BAO PHẤN VÀ HẠT PHẤN ... 64
1. TÍNH ĐƠN BỘI CỦA THỰC VẬT ... 64
2. PHƯƠNG PHÁP TẠO THỂ ĐƠN BỘI IN VIVO ... 65
2.1. Sinh sản đơn tính cái (gynogenesis) ... 65
2.2. Sinh sản đơn tính đực (androgenesis) ... 65
2.3. Sự đào thải hệ gen bằng lai xa ... 65
2.4. Sự giao phối không hoàn toàn (semigamy) ... 65
2.5. Xử lý hóa chất ... 65
2.6. Shock nhiệt ... 66
2.7. Ảnh hưởng của chiếu xạ ... 66
3. PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐƠN BỘI IN VITRO ... 66
3.1. Phương thức phát sinh cây đơn bội... 66
3.2. Các bước phát triển bình thường và phát triển phôi của hạt phấn ... 69
4. HIỆN TƯỢNG BẠCH TẠNG TRONG NUÔI CẤY ĐƠN BỘI ... 72
5. ỨNG DỤNG CỦA THỂ ĐƠN BỘI ... 72
5.1. Nghiên cứu về phôi học thực nghiệm ... 72
5.2. Nghiên cứu về tế bào học ... 72
5.3. Nghiên cứu đột biến và di truyền ... 73
5.4. Cải thiện giống cây trồng ... 73
6. NHỮNG TỒN TẠI TRONG NGHIÊN CỨU ĐƠN BỘI ... 76
6.1. Các vấn đề nảy sinh trong quá trình hình thành thểđơn bội ... 76
6.2. Những vấn đề cụ thể ... 77
7. QUY TRÌNH TẠO CÂY ĐƠN BỘI THUỐC LÁ TỪ HẠT PHẤN PHÂN LẬP 77 7.1. Cảm ứng ... 77
7.2. Nuôi bao phấn ... 78
7.3. Tách và nuôi hạt phấn ... 78
TÓM TẮT CHƯƠNG ... 78
CÂU HỎI ... 79
Chương 6. PROTOPLAST THỰC VẬT ... 80
1. GIỚI THIỆU VỀ PROTOPLAST ... 80
2. PHÂN LẬP PROTOPLAST... 80
2.1. Các phương pháp phân lập protoplast ... 80
2.2. Nguyên liệu phân lập protoplast ... 83
3. NUÔI CẤY PROTOPLAST ... 85
3.1. Môi trường nuôi cấy ... 85
3.2. Phương pháp nuôi cấy ... 88
3.3. Tái sinh cây từ protoplast ... 90
4. ỨNG DỤNG CỦA PROTOPLAST THỰC VẬT ... 93
4.1. Chọn dòng tế bào ... 94
4.2. Dung hợp protoplast ... 94
5. CHỌN LỌC CÁC THỂ LAI SOMA ... 97
6. TỒN TẠI CỦA KỸ THUẬT PROTOPLAST ... 100
6.1. Phân lập ... 101
6.2. Điều kiện nuôi cấy ... 101
6.3. Sự phân bào ... 101
TÓM TẮT CHƯƠNG ... 101
CÂU HỎI ... 102
Chương 7. BIẾN DỊ DÒNG SOMA ... 103
1. KHÁI NIỆM... 103
2. PHÂN LOẠI BIẾN DỊ DÒNG SOMA ... 103
2.1. Biến dị kiểu gene ... 103
2.2. Biến dị kiểu hình ... 103
2.3. Cơ sở phân tử của biến dị ... 104
3. CÁC NGUYÊN NHÂN CHÍNH GÂY RA BIẾN DỊ DÒNG SOMA ... 105
3.1. Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy ... 105
3.2. Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy ... 105
4. CHỌN LỌC BIẾN DỊ DÒNG SOMA ... 106
4.1. Phương pháp chọn dòng ... 107
4.2. Phân lập biến dị ... 107
4.3. Xử lý đột biến ... 117
5. BẢN CHẤT CỦA BIẾN DỊ DÒNG SOMA ... 117
6. ỨNG DỤNG BIẾN DỊ DÒNG SOMA TRONG CÔNG TÁC GIỐNG CÂY TRỒNG ... 117
TÓM TẮT CHƯƠNG ... 119
CÂU HỎI ... 119
CHƯƠNG 8. BIẾN NẠP DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT ... 120
1. CÁC KỸ THUẬT CHUYỂN GEN ... 122
1.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium ... 123
1.2.Chuyển gen bằng phương pháp bắn gen ... 131
1.3. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast bằng xung điện ... 134
1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast bằng kỹ thuật vi tiêm ... 135
2. SỰ HỢP NHẤT VÀ BIỂU HIỆN CỦA DNA NGOẠI LAI TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT ... 135
3. MỘT SỐ KẾT QUẢ BIẾN NẠP Ở THỰC VẬT ... 136
3.1. Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gen thành công ... 136
3.2. Biến nạp gene nif... 142
4. TRIỂN VỌNG VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN ... 143
4.1. Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ ... 143
4.2.Chuyển gen kháng sâu ... 144
4.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus nhờ chuyển nạp gen protein vỏ virus ... 144
4.4. Chuyển gen tạo tính bất dục ở cây trồng ... 144
4.5. Chuyển gen tạo giống hoa có kiểu và màu sắc mới ... 145