Vấn đề có tầm quan trọng đáng kể và cũng là vấn đề quyết định cuối cùng đối với thực tiễn nông nghiệp liên quan tới thời gian duy trì được cây trồng sạch virus.
Sau khi các mẫu nhiễm được tẩy sạch virus thì việc nhân nhanh giống sạch bệnh và duy trì độ sạch virus của giống là vô cùng quan trọng. Thông thường các cây hoặc củ sạch bệnh được tạo ra từ cây hoặc củ nuôi cấy mô phải được trồng trong điều kiện cách ly với các nguồn bệnh (trồng trong nhà màng, nhà lưới) và các vector truyền bệnh (rệp, bọ phấn, nhện…).
Sau giai đoạn trồng trong nhà màn, nhà lưới thì có thể nhân nhanh các giống sạch bệnh ở các vùng cách ly xa với nguồn bệnh. Trong vùng cách ly, không được phép có mặt các cây bị bệnh hay các cây cùng họ mang bệnh và cách xa các vùng sản xuất thông thường. Mặt khác, vùng cách ly còn là vùng có mật độ côn trùng truyền bệnh thấp hoặc có tốc độ gió cũng như các điều kiện sinh thái khác không thích hợp cho sự di chuyển và sinh sôi của chúng. Ví dụ, vùng sản xuất khoai tây thường là các vùng ven biển như vùng Bretagne của Bắc Pháp, Hamburg, Rostock ở Bắc Đức.
Để duy trì độ sạch cần tiến hành vệ sinh đồng ruộng, quan sát ruộng trồng liên tục, nhổ bỏ kịp thời các cây bị tái nhiễm virus.
Đối với thực tiễn sản xuất thì cây được coi là bị bệnh chỉ khi nào năng xuất giảm xuống. Hiện nay, trong sản xuất nông nghiệp và trồng cây ăn quả vấ n đề này còn chưa được giải quyết thỏa đáng . Việc sản xuất dòng Elite trong qui trình sản xuất khoai tây giống kéo dài nhiều năm , trong khi đó nguy cơ tái nhiễm thông qua yếu tố truyền bệnh luôn tồn tại và phụ thuộc vào điề u kiện khí hậu. Trong ngành trồng hoa tình hình thuận lợi hơn nhiều . Hiện nay ở CHLB Đức với tập đoàn nhân (nucleus clone) của hoa cúc và nelken người ta duy trì được tính sạch bệnh trong một năm rưỡi, trong khi chỉ cần một n ăm là có thể thay được hoàn toàn tập đoàn giống . Vì vậy, vấn đề nêu ra ở trên có thể được trả lời tóm tắt như sau: khối lượng và chất lượng vật liệu có sẳn ban đầu xác định khả năng sản xuất một vụ không bị giảm năng xuất do bệnh virus.
Giảm năng xuất có thể xuất hiện nếu nguồn giống sạch virus bị nhiễm sớm . Đối với khoai tây thì nhiễm chủ yếu do các yếu tố truyền bệnh sống ở điều kiện tự nhiên đối với cây hoa thì tái nhiễm xảy ra khi đưa cây giống sạch bệnh vào các xí nghiệp sản xuất bị nhiễm sẳn. Có thể nói rằng trong ngành trồng hoa qui trình làm sạch virus được
coi như mô hình phương pháp . Cũng qua đó có thể nhận thấy phương pháp làm sạch virus không phải là biện pháp chữa bệnh một lần mà là một quá trình phức tạp đối với cây trồng đã bị bệnh từ trước.
Người ta có thể so sánh bệnh virus của thực vật nhân giống vô tính như bệnh xã hội của con người không thể chữa bằng thuốc men mà phải thay đổi cả thói quen sinh hoạt. Ở các xí nghiệp công nghiệp sản xuất cây trồng có thể gọi các tiến bộ khoa học kỹ thuật là một loại stress khi mà từ một cây cúc mẹ một năm cho 100 cây ươm, trước kia chỉ thu được 15 và một cây ươm chỉ cần 11 ngày để ra rễ trong khi trước đây cần 21 ngày. Để tạo điều kiện cho các xí nghiệp sản xuất công nghiệp cây giống thu được những thành tích to lớn hơn nữa thì việc đầu tư hàn g năm cho công tác chống bệnh virus trở nên cần thiết. Trong trường hợp nhân giống vô tính in vitro thì việc làm sạch virus càng phải được coi là điều kiện trước tiên.
TÓM TẮT CHƯƠNG
Các phương pháp làm sạch virus
+ Xử lý nhiệt: Dùng nhiệt độ cao để ức chế sự sinh sản của virus. Tùy từng loài chọn nhiệt độ thích hợp để đảm bảo mẫu nuôi sinh trưởng bình thường.
+ Nuôi cấy đỉnh phân sinh: Trong thực vật, đỉnh phân sinh thì hoàn toàn sạch virus. Vì vậy, sử dụng đỉnh phân để nuôi cấy để làm sạch virus.
+ Kỹ thuật vi ghép: ghép mô phân sinh đỉnh lên gốc ghép sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch bệnh virus.
+ Xét nghiệm virus: Xét nghiệm từ lúc tái sinh cây cho đến khi cây 4-6 tháng tuổi để các thể virus còn tồn tại trong thực vật đạt được nồng độ cần thiết cho việc xét nghiệm đảm bảo độ chính xác.
Kiểm định là phương pháp kiểm tra cuối cùng trong quy trình khép kín: sau khi xét nghiệm virus phải tiến hành kiểm định .
Duy trì tính sạch bệnh của virus: Sau khi các mẫu đã sạch bệnh virus thì tiến hành nhân giống và duy trì độ sạch virus của giống
CÂU HỎI
Câu 1: Hãy trình bày nguyên lý làm sạch virus và duy trì tính sạch bệnh virus? Câu 2: Hãy phân tích các phương pháp làm sạch virus?
Chương 10. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP
Thực vật là nguồn cung cấp nhiều loại sản phẩm phục vụ đời sống loài người bao gồm thực phẩm, vật liệu, hương liệu, dược phẩm… Số lượng các hợp chất hóa học đã biết đến ở thực vật được đánh giá là nhiều gấp 4 lần so với giới Vi sinh vật. Trên thế giới, 121 các thuốc điều trị bệnh là bắt nguồn từ thực vật. Cho đến ngày nay, 75% dân số thế giới vẫn dựa vào các cây thuốc truyền thống. Rõ ràng, sự đa dạng di truyền của thực vật làm cho chúng trở thành một nguồn sản xuất các chất hóa học đầy tiềm năng.
Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp (bậc 2) là những sản phẩm được tạo ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất, sau đó, chúng thoát ra khỏi tế bào đi ra môi trường ngoài. Phần lớn các sản phẩm thứ cấp thường không có nhiều ý nghĩa sinh lý đối với bản thân các tế bào. Quá trình tạo ra những sản phẩm thứ cấp chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tượng sinh tổng hợp thừa. Chúng còn là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường chung quanh, là sự thích nghi với stress của môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Các chất trao đổi thứ cấp hay còn gọi là các chất thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính:
- Alkaloid: có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Người ta thường gặp trong một cây tập hợp các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Đôi khi toàn thân chưa alkaloid, đôi khi chỉ tập trung trong lá (thuốc lá, chè, cacao), trong quả (thuốc phiện), trong vỏ (cây canh-ki-na, họ Rubiaceae), trong rễ (cây phụ tử, cây cà độc dược). Trong cùng một cây có thể tùy theo bộ phận của cây mà tạo ra những alkaloid khác nhau. Các alkaloid có các hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số tác dụng lên hệ thần kinh (caffein, atropin, strychnin…), một số tác dụng lên các cơ (veratrin, atropin…), một số tác dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrin…), một số khác tác dụng lên bộ máy hô hấp (morphin…). Alkaloid thường độc với liều lượng lớn, nhưng với liều lượng nhỏ chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994).
- Tinh dầu: chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung môi. Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước. Terpene được xây dụng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene, ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị isoprene (Lee 2001).
- Glycoside: bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm (Lee 2001).
Một số con đường có thể sản xuất hợp chất thứ cấp bao gồm: - Tổng hợp hóa học
- Phát triển vùng trồng trọt các cây dùng để chiết xuất nguyên liệu - Sản xuất chất đồng hóa trong các cây trồng biến đổi gen
- Sản xuất trong nuôi cấy tế bào.
Ngoài kỹ thuật hóa học và kỹ thuật dược học đang phát triển một cách nhanh chóng và hiện đại thì thực vật bậc cao vẫn là một nguồn cung cấp các hợp chất hóa học
và dược liệu rất quan trọng . Tuy nhiên trong những năm gần đây sản lượng các thực vật đó rất khó đảm bảo ở mức ổn định do hậu quả của một số yếu tố như:
- Điều kiện tự nhiên không thuận lợi. - Chi phí lao động ngày càng tăng.
- Khó khăn kỹ thuật và kinh tế trong trồng trọt.
Phương pháp nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng) của thực vật có khả năng góp phần giải quyết những khó khăn trên . Những tiến bộ của kỹ thuật này trong những năm gần đây đã được nhiều công trình tổng kết. Nuôi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các chất tự nhiên có một số ưu điểm sau:
- Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô.
- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản
phẩm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản.
- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất
từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh.
Thách thức lớn nhất đối với công nghệ tế bào thực vật là sự ổn định cho phép nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn và đạt hiệu suất tối đa cho sự tích lũy và sản xuất các hợp chất tự nhiên (hay còn gọi là các sản phẩm thứ cấp). Điều này có thể thực hiện bằng cách chọn lọc các kiểu gen thích hợp và các dòng tế bào có sản lượng cao, xây dựng các công thức môi trường dinh dưỡng hợp lý để nuôi cấy tế bào, thiết kế và vận hành các hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu quả. Chúng ta cũng có thể sử dụng kinh nghiệm và kiến thức có được từ nuôi cấy vi sinh vật để áp dụng cho nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, tế bào thực vật và vi sinh vật có một số đặc điểm khác nhau, vì thế cần phải cải biến và điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy cũng như cấu hình của nồi phản ứng (bioreactor) để tìm được các yêu cầu đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật.
Một số đặc điểm chính khác nhau giữa tế bào thực vật và vi sinh vật: - Tế bào thực vật lớn hơn tế bào vi khuẩn hoặc vi nấm từ 10-100 lần.
- Sự trao đổi chất của tế bào thực vật chậm hơn vì thế đòi hỏi phải duy trì một điều kiện vô trùng trong thời gian lâu hơn.
- Tế bào thực vật có khuynh hướng kết thành một khối gây ra sự lắng đọng, có khả năng hòa trộn kém.
- Quá trình sản xuất các chất thứ cấp ở tế bào thực vật phụ thuộc các cơ chế điều hòa phức tạp hơn so với các tế bào vi sinh vật.
- Các tế bào thực vật có độ ổn định di truyền thấp hơn tế bào vi sinh vật.