3.1. Xử lý nhiệt
Quá trình xử lý nhiệt được coi như là biện pháp làm sạch bệnh có cơ sở thực tiễn. Những cây mía mắc bệnh có thể cho năng suất cao sau khi ngâm ở nước nóng , các nghiên cứu về vấn đề này cho thấy dùng không khí nóng thuận lợi hơn đối với hầu hết cây trồng bởi vì chúng có thể chịu đựng tốt hơn và virus bị loại trừ dần dần. Những hiểu biết của chúng ta về quá trình làm sạch bệnh thông qua xử lý nhiệt còn chưa đầy đủ. Người ta nêu ra giả thiết chung là virus bị ức chế sinh sản ở nhiệt độ từ 34-40o
C. Quá trình sinh trưởng của thực vật trong khi xử lý nhiệt cũng bị ức chế nhưng ít hơn vì thế những bộ phận vừa được sinh trường thường sạch h oặc nghèo virus . Kết quả xử lý nhiệt còn cho thấy cơ thể thực vật có thể được bảo tồn ở trạng thái tối thích trong một thời gian dài ở nhiệt độ cao . Tốt nhất là nên xử lý với chu kỳ quang 16 giờ/ngày. Nhiệt độ phải được kiểm tra liên tục bằng máy ghi tự động để đảm bảo cung cấp lượng nhiệt năng cần thiết , độ ẩm tương đ ối phải đạt trung bình là 50%. Để đảm bảo sự phân bố nhiệt độ đồng đều trong phòng cần phải có quạt gió . Mỗi một loài cây
hoa thường mẫn cảm rất khác nhau đối với nhiệt độ cao trong khi xử lý , ví dụ: hoa cúc có khả năng chịu đựng nhiệt rất lớn: 38oC trong thời gian nửa năm tiếp theo là hoa anh túc. Hoa thủy tiên thì chịu được nhiệt độ 34o
C trong thời gian từ 4-6 tuần.
3.2. Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem)
Mô phân sinh đỉnh là phần đỉnh ngọn có hình cầu và một số lá bao mầm non, không chưa mô mạch. Người ta đã chứng minh được rằng nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng riêng đỉnh phân sinh thì hoàn toàn sạch virus.
Thực tế này đã được ứng dụng để làm sạch virus bằng cách tách đỉnh sinh trưởng ở điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy chúng thành thực vật hoàn chỉ nh. Trong nuôi cấy, các cây con tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng có tính ổn định di truyền rất cao. Do chồi hình thành trực tiếp từ mô phân sinh mà không qua giai đoạn hình thành callus hoặc tái sinh các cơ quan bất định nên tính không ổn định di truyền và biến dị soma được hạn chế tối đa.
Các ưu điểm chính của nuôi cấy mô phân sinh:
- Tạo cây sạch bệnh virus cũng như các bệnh truyền nhiễm khác - Nhân giống vô tính cây trồng với sự ổn định di truyền cao nhất - Ứng dụng trong bảo quản nguồn gen
- Vi nhân giống chính xác các kiểu gen
- Đáp ứng các quy định về kiểm dịch trong vận chuyển quốc tế.
Việc phân lập đỉnh phân sinh có kích thước 0,01-0,1 mm rất khó khăn và việc tái sinh thành cây hoàn chỉnh cũng chỉ đạt được với tần số rất thấp (0,2-5%) vì vậy người ta thường phân lập cả chồi ngọn và gọi nó là đoạn đỉnh (shoot tips ) có kích thước từ 0,1- 1 mm qua đó tính sạch bệnh của mẫu vật nuôi cấy bị giảm xuống nhưng tốc độ tái sinh cây được tăng l ên và đó chính là phương pháp được ứng dụng trong thực tiễn Thao tác tách mô phân sinh đỉnh cũng giống như thao tác đã làm trong nhân giống in vitro bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh.
Khái niệm sạch virus của thực vật không có nghĩ a là cần phải có đỉnh phân sinh hoàn toàn sạch các phần tử virus mà nó được hoàn thiện trong quá trình phân hóa của các tế bào chưa phân hóa . Vì vậy, trong thực tiễn phải giới hạn nồng độ virus và khối lượng mô phân hóa ở một mức nhất định nếu cần có thực vật sạch virus.
Việc phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh phân sinh là phương pháp rất thuận lợi bởi vì thông qua xử lý nhiệt quá trình sinh sản của virus trong chồi ngọn bị ức c hế mạnh và thông qua quá trình phân hóa đỉnh phân sinh tính sạch virus sẽ được đả m bảo với độ xác suất cao . Biện pháp này cho phép có thể tách mô phân sinh ở kích thước lớn hơn (0,5-1,0mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở kích thước 0,1-0,2mm. Có thể xử lý nhiệt độ cao 35-37o
C một thời gian dài cho cây mẹ trước khi tách mô phân sinh đỉnh (5-10 tuần). Hoặc có thể xử lý các mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy in vitro ở nhiệt độ 39-40o
C trong 1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao.
Các hóa chất diệt virus như ribavirin (virazole) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô phân sinh. Đây là một chất tương tự với guanosine – có khả năng kháng lại virus ở động vật và khi có mặt trong cây bị nhiễm virus nó cũng ngăn chặn sự tái bản của virus, nhưng nếu nồng độ ribavirin quá cao thì có thể gây độc và làm chết mẫu cấy.
Theo quan điểm lý thuyết và kinh nghiệm thực tiễn người ta thu đượ c những kết quả khác nhau trong từng phòng thí nghiệm, nếu việc nuôi cấy đỉnh phân sinh được thực hiện trên quan điểm sản xuất lớn thì cần phải chú ý những mặt sau đây:
- Đảm bảo độ đồng nhất của giống trong tất cả các khâu nuôi cấy
- Đảm bảo tốc độ sinh trưởng nhanh và đều đối với một số lượng đỉnh phân sinh lớn đồng thời
- Kết quả đưa cây ra đất cũng cần phải được bảo đảm.
Các đỉnh sinh trưởng sau khi phân lập cần được nuôi ở các buồng nuôi cây hoàn toàn khống chế về mặt khí hậu: nhiệt độ 22o
C và 16 giờ chiếu sáng ở 1.000-3.000 lux . Khi đưa cây tái sinh từ đỉnh phân sinh ra ngoài đất cần phải phủ nilon để chúng thích nghi dần với độ ẩm không khí thấp. Tốt nhất là nên trồng ở các buồng nuôi cây cách ly có thông khí và hoàn toàn sạch rệp lá . Từ tháng 10 đến tháng 3 cần phải chiếu sáng thêm, nhưng trong mùa hè lại phải che bớt ánh sáng.
3.3. Kỹ thuật vi ghép (micrografting)
Vi ghép là kỹ thuật ghép mô phân sinh đỉnh lên gốc ghép sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch bệnh virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với cây thân gỗ, đặc biệt là họ Cam, Chanh. Kỹ thuật này có thể thực hiện được cả in vivo và in vitro.
Gốc ghép dùng trong vi ghép chủ yếu là cây con mới nảy mầm. Trong một số trường hợp có thể sử dụng các chồi in vitro. Nếu sử dụng cây gieo từ hạt, hạt cần được khử trùng và gieo trên môi trường MS nền thạch cứng.
Mô phân sinh đỉnh dùng để vi ghép có thể lấy từ chồi đỉnh hoặc chồi nách phát triển khỏe mạnh trong in vivo hoặc từ chồi in vitro. Sự sống sót của đỉnh vi ghép phụ thuộc chủ yếu vào kích thước của chúng. Thao tác tách mô phân sinh đỉnh cũng giống như thao tác đã làm trong nhân giống in vitro bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh (các thao tác này thường được thực hiện dưới kính hiển vi). Tùy theo các loại cây mà kích thước mô phân sinh có thể dao động từ 0,2-0,5mm. Các mô phân sinh đỉnh này được nuôi cấy trong môi trường khởi đầu (MS + 0,01mg/l Zeatine) khoảng 2 tuần cho đến khi đạt được kích thước 10mm thì có thể tiến hành ghép.
Khi vi ghép được thực hiện trong điều kiện in vitro, khâu khó khăn nhất là chuyển thành công cây ghép ra môi trường bên ngoài. Vì thế, nhiều tác giả đã đề xuất nên thực hiện vi ghép trong điều kiện in vivo. Khi đó, tỷ lệ vết ghép liền mạch có thể ít hơn so với điều kiện in vitro, nhưng không còn khó khăn khi chuyển cây ghép ra điều kiện tự nhiên.
Hiện nay, công nghệ sản xuất các giống cây sạch bệnh bắt nguồn từ kỹ thuật nuôi cấy mô là công nghệ phổ biến và bắt buộc ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam cũng đã nghiên cứu thành công và đang bắt đầu triển khai hệ thống sản xuất giống sạch virus cho cây khoai tây, cam quýt. Đây là hai đối tượng bị virus gây thoái hóa nghiêm trọng.
3.4. Xét nghiệm virus
Không phải tất cở các loài cây sau quá trình xử lý phối hợp nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì đều sạch virus , vì vậy cần phải tiến phải xét nghiệm khoảng thời gian từ lúc tái s inh cây cho tái khi xét nghiệm phải từ 4 đến 6 tháng để các thể virus còn tồn tại trong thực vật đạt được nồng độ cần thiết cho việc xét nghiệm đảm bảo độ chính xác. Xét nghiệm virus trong khuôn khổ của qui trình làm sạc h virus hoàn toàn khác quá trình phân tích virus ở một cây trồng. Đối với việc làm sạch virus thì độ
chính xác của phương pháp thử virus trong mỗi loài xét nghiệm mang ý nghĩa quyết định cho nên mỗi một cây cần được xét ng hiệm theo nhiều phương pháp khác nhau trong đó cần chú ý tới các phương pháp xét nghiệm những loài virus phổ biến và có ý nghĩa kinh tế. Đối với việc phân tích virus một loài cây trồng người ta chỉ chú ý tới số lượng cũng như sự phân loại của chúng.
Độ nhạy cảm của mỗi phương pháp xét nghiệm có vai trò thứ yếu , sau đây là một số phương pháp xét nghiệm virus được ứng dụng trong trồng trọt các loài cây hoa:
3.4.1. Xét nghiệm bằng cây chỉ thị
Dùng dịch ép của thực vật cần được xét nghiệm gây bệnh trên một cây chỉ thị thích hợp hoặc dùng phương pháp ghép có thể chứng minh được bệnh virus . Chỉ sau khi thực hiện phương pháp thử này kết luận về bệnh virus mớ i thực sự đảm bảo tính chính xác của nó.
Phương pháp thử bằng cây chỉ thị luôn được coi là phương pháp xác định đầu tiên và cũng là phương pháp nhạy cảm nhất , tuy nhiên kết quả xét nghiệm cũng còn phụ thuộc các yếu tố khác nữa.
Trong trường hợp xét nghiệm hàng loạt công việc gây bệnh nhân tạo đối với số lượng cây chỉ thị là 10.000 đến 100.000 ở một thời gian nhiều tháng thì độ chính xác của phương pháp giảm đi vì không thể tiến phải các thí nghiệm lặp lại . Tuổi của cây trồng cũng như trạng thái sinh lý của chúng trong các mùa khác nhau của một năm ảnh hưởng rất nhiều đến tính chính xác của phương pháp xét nghiệm.
Vì lý do đó, trong trường hợp phải xét nghiệm hàng loạt phương pháp dùng cây chỉ thị không đảm bảo bằng phương pháp miễn dịch . Nếu chỉ xét nghiệm một số lượng cây vừa phải ví dụ 1.000 cá thể thì phương pháp dùng cây chỉ thị không cần thay bằng phương pháp khác vì công việc có thể tiến hành trong một thời vụ thích hợp.
Triệu chứng bệnh lý có thể quan sát được sau 3-5 ngày song thông thường là sau hai tháng vì vậy cần một diện tích nhà kính khá rộng trong một thời gian tương đối dài chi phí cho xét nghiệm bằng phương pháp cây chỉ thị thường đắt gấp ba lần so với phương pháp huyết thanh.
3.4.2. Phương pháp huyết thanh
Tính đặc hiệu cao của phương pháp huyết thanh là một đặc điểm quan trọng . Ngoài ra, phương pháp này còn cho phép xác minh nhanh sự tồn tại của virus và phân loại chúng. Kết quả thu được chậm nhất là sau 48 giờ. Chi phí cho xét nghiệm thấp, để chứng minh virus không cần có nhà kính trồng cây.
Phương pháp huyết thanh lại có độ chính xác cao , tuy nhiên người ta chưa sản xuất được kháng thể đối với tất cả các loài virus và kể cả khi có huyết thanh rồi cũng chưa có thể nói rằng kết quả xét nghiệm hoàn toàn bảo đảm . Vì rằng với phương pháp này người ta không thể xác minh được đặc tính gây bệnh của từng loài virus đối với thực vật chủ, có nhiều phương pháp huyết thanh khác nhau đã được ứng dụng trong xét nghiệm hàng loạt đối với cây hoa, trong đó có phương pháp kết tủa giọt , xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều , xét nghiệm latex, xét nghiệm miễn dịch hướng tâm...
Mỗi một phương pháp đều có ưu và nhược điểm đặc trưng thông số về độ chính xác thường thu được với dãy nồng độ dịch ép từ thực vật hoặc virus phân lập . Nhiều nghiên cứu cho thấy không thể coi độ nhạy cảm này thường thu được khi pha loãng dịch ép nhiều lần hoàn toàn cho phép tin tưởng vào kết quả xét nghiệ m hàng loạt. Vì thế cần chọn phương pháp thích hợp cho xét nghiệm hàng loạt.
3.4.3. Xét nghiệm bằng kính hiển vi điện tử
Kính hiển vi điện tử với sự hoàn chỉnh về kỹ thuật và sau khi ứng dụng phương pháp nhúng có thể đưa vào xét nghiệm hàng loạt với số lượng mẫu vừa phải . Khi chứng minh virus hình đũa và hình sợi ở hoa phong lan và hoa huệ kính hiển vi điện tử đã mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với xét nghiệm hàng loạt . Khó khăn chủ yếu hiện nay là chi phí cho thiết bị và số lượng mẫu được xét nghiệm bị hạn chế , đồng thời loại virus được chứng minh cũng chỉ là loại hình đũa và hình sợi.
Nếu virus tồn tại dạng cầu thì rất khó phát hiệ n vì nó khá giống các cơ quan tử của tế bào thực vật bình thường.
3.4.4. Xét nghiệm virus bằng phương pháp PCR
Hiện nay, một phương pháp được sử dụng phổ biến của công nghệ sinh học có rất nhiều tiềm năng ứng dụng đó là khuếch đại gen bằng phản ứng trùng hợp polymerase (polymerase chain reaction) trên máy PCR.
Bằng cách thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu của các gen gây bệnh ở virus, người ta có thể khuếch đại các gen này (nếu có) từ DNA hệ gen của thực vật đã được xử lý làm sạch virus. Nếu không xuất hiện sản phẩm PCR đặc trưng của gen virus sau khi phân tích điện di agarose gel thì ta có thể kết luận là cây đã được làm sạch bệnh hoặc ngược lại, cây được xử lý vẫn còn mang virus. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, chính xác và ít tốn kém hơn các phương pháp nói trên. Hiện nay, người ta đã sản xuất một thiết bị phân tích PCR có độ nhạy rất cao gọi là Realtime-PCR (PCR thời gian thực hay còn gọi là PCR định lượng) cho phép phân tích với một nồng độ virus vô cùng thấp ở những sinh vật mới bị nhiễm bệnh. Kỹ thuật này đã khắc phục được thời gian chờ đợi virus sinh sản tới một nồng độ đủ cao để đảm bảo độ chính xác của phương pháp xét nghiệm.
Phương pháp phân tích PCR đã được ứng dụng rất rộng rải để chẩn đoán bệnh ở người như sốt xuất huyết Dengue, viêm gan B, viêm gan C, Chlamydia... Và rõ ràng nó rất hữu ích trong việc ứng dụng để xét nghiệm các thực vật bị nhiễm bệnh virus, vi khuẩn hoặc vi nấm...