2.8.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng
Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2. a)Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2.
Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase theo thời gian và xác định thời gian nuôi cấy để thu được enzyme có hoạt độ cao nhất, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường Czapek-dox, lắc với tốc độ 180 vòng/phút. Quá trình nuôi cấy chủng Trichoderma
longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2 để thu nhận canh trường
có hoạt tính cellulase được thực hiện trong môi trường khảo sát khả năng sinh tổng hợp cellulase. Sau các khoảng thời gian: 0-168 giờ (cách nhau 12 giờ) lấy dịch enzyme thô từ canh trường nuôi cấy và xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp so màu với thuốc thử DNS. Kết quả được trình bày ở bảng 2.62 và hình 2.5.
Hình 2.5. Sự biến thiên hoạt độ cellulase của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5,
Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2 theo thời gian nuôi cấy
Bảng 2.62. Sự biến thiên hoạt độ cellulase của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2, Aspergillus oryzae N2 theo thời gian nuôi cấy
Chủng Thời gian (giờ)
Trichoderma longibrachiatum Y5 Aspergillus niger T2 Aspergillus oryzae N2 12 4,91ts 43,84qpo 0,16t 24 20,1trqs 46,53nqpo 0,63t 36 24,5traps 49,54opq 1,58t 48 29,28rqps 62,68onp 2,69ts 60 34,35rqp 64,10mno 13,03ust 72 137,23lk 68,69nmo 46,38nqpo 84 180ih 121,72l 73,124nm 96 229,03f 158,59ikj 84,942m 108 274,93de 191,20gh 118,181l 120 303,42c 221,27f 127,99l
132 333,49b 259,58e 157,01ikj
144 358,82a 287,59dc 176,11ih
156 276,51de 266,70de 207,4gf
168 130,9l 168,09ihj 143,14lkj
Ghi chú:
- Số liệu thu được là giá trị trung bình của n = 3.
- Các số liệu trong bảng có số mũ khác nhau thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa (α = 0,05).
Dựa vào đồ thị ở hình 2.5 ta thấy khả năng sinh cellulase của các chủng phụ thuộc nhiều vào thời gian nuôi cấy, thời gian càng dài thì hoạt độ cellulase càng cao.
Theo dõi sự biến thiên hoạt độ cellulase trong môi trường nuôi cấy cho thấy trong giai đoạn đầu 12-60 giờ hoạt độ enzyme có sự tăng nhẹ, chủng Aspergillus niger T2 cho hoạt độ tại 60 giờ (64,10 UI/ml) cao gấp 1,86 lần so với Trichoderma longibrachiatum Y5 và gấp 4,92 lần so với chủng Aspergillus oryzae N2. Sau đó hoạt độ cellulase của chủng vi nấm tăng nhanh từ 60-156 giờ và đạt cực đại tại 144 giờ (358,82 UI/ml) đối với Trichoderma
longibrachiatum Y5; 144 giờ (287,59 UI/ml) đối với Aspergillus niger T2 và 156 giờ (207,4
UI/ml) đối với Aspergillus oryzae N2. So sánh khả năng sinh cellulase của 3 chủng vi nấm chúng tôi nhận thấy rằng chủng Trichoderma longibrachiatum Y5 đạt giá trị cao nhất, cao gấp 1,25 lần chủng Aspergillus niger T2 và gấp 1,73 lần Aspergillus oryzae N2.
Sau khoảng thời gian đạt cực đại thì hoạt độ enzyme giảm dần. Sau 168 giờ nuôi cấy hoạt độ của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5 đạt 36,5% so với mốc cực đại. Chủng
Aspergillus niger T2 đạt 58,45% và Aspergillus oryzae N2 đạt 69,01% so với cực đại.
Khả năng sinh enzyme của chủng vi nấm tỉ lệ với đường cong sinh trưởng. Ở giai đoạn đầu chủng vi nấm tập trung vào quá trình tăng kích thước và thể tích tế bào chưa tập trung vào tạo sản phẩm trung gian. Tuy nhiên sau giai đoạn này thì tập trung vào quá trình tạo enzyme là sản phẩm của quá trình trao đổi chất với số lượng và chất lượng rất cao. Vì thế nếu mục đích của quá trình nuôi cấy là thu nhận enzyme thì người ta thường kết thúc quá trình ở cuối giai đoạn này. Ở giai đoạn cuối, sinh khối chết dần, chất dinh dưỡng cạn kiệt và sản phẩm trao đổi chất trong môi trường quá nhiều gây ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào nên việc sản sinh enzyme cũng giảm theo (Đặng Thị Thu và cs, 2003; Trương Phước Thiên Hoàng, 2007).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước. Điển hình là nghiên cứu của Sandu D.K và Sandu M.K. (1985), cho rằng 6 ngày là thời gian để chủng T. longibrachiatum sinh tổng hợp cellulase cao nhất. Nghiên cứu Kang và cs (2004), chủng Aspergillus niger KK2 có thời gian sinh tổng hợp CMCase và β- glucosidase cao nhất là 144 giờ tương ứng giá trị hoạt độ lần lượt là 129 UI/g và 100 UI/g . So sánh với một số chủng nấm khác thì chúng tôi nhận thấy hoạt độ cellulase được sinh tổng hợp từ Asp.oryzae VTCC-F-045 cao nhất là sau 120 giờ tương ứng giá trị hoạt độ là 2,34 UI/ml (Nguyễn Hữu Quân, 2009). Ngoài ra, một số nghiên cứu về các chủng
nấm mốc khác như Aspergillus oryzae sinh tổng cellulase cao nhất sau 120 giờ (Lê xuân Phương, 2002). Điều này cho thấy các chủng khác nhau thì thời gian sinh tổng hợp cellulase thích hợp là khác nhau.
Thời gian thích hợp để chủng nấm mốc T. longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 sinh tổng hợp cellulase cao nhất là 144 giờ và Aspergillus oryzae N2 là 156 giờ chúng tôi chọn khoảng thời gian này để nghiên cứu tiếp theo.
b) Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2.
Nhiệt độ là thông số quan trọng, ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme và khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc. Để đánh giá mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ và xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng vi nấmchúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm trong môi trường khảo sát khả năng sinh tổng hợp cellulase tại thời gian 144 giờ đối với T. longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và 156 giờ đối với Aspergillus
oryzae N2 ở các nhiệt độ khác nhau như 240C, 260C, 280C, 300C, 320C, 340C và 360C. Kết quả được trình bày ở hình 2.6.
Hình 2.6. Đồ thị về sự biến thiên hoạt độ cellulase của chủng Trichoderma
longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2 theo nhiệt độ
Kết quả ở đồ thị 2.6. cho thấy khoảng nhiệt độ tối thích của các chủng vi nấm 280C- 300C. Khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5 có hoạt độ đạt cực đại là 380,98 UI/ml tại 280C. Khi nhiệt độ tăng 360C thì hoạt độ cellulase giảm mạnh và tại 360C hoạt độ cellulase chỉ còn 156,22 UI/ml đạt 41% so với hoạt độ cực đại.
Tương tự chủng Aspergillus oryzae N2 cũng cho hoạt độ cellulase cực đại tại 280C là 218,90 UI/ml. Khi nhiệt độ tăng lên 360C thì hoạt độ cellulase còn 42,63 UI/ml đạt 0,914% so với cực đại
Chủng Aspergillus niger T2 có nhiệt độ tối thích cao hơn là 300C. Tuy nhiên khi có sự gia tăng nhiệt độ thì hoạt độ cellulase cũng có chiều hướng giảm tại 360C hoạt độ là 155,87 UI/ml đạt 0,47% so với cực đại.
So sánh hoạt độ enzyme giữa các chủng vi nấm chúng tôi thấy khả năng sinh tổng hợp cellulase tại các khoản nhiệt độ tối ưu thì hoạt độ của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5 cao nhất, cao gấp 1,16 lần so với Aspergillus niger T2 và gấp 1,74 lần so với Aspergillus
oryzae N2.
Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của nấm mốc. Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với vùng nhiệt độ khác nhau, ngoài khoảng nhiệt độ này vi sinh vật sẽ bị hạn chế phát triển cũng như hạn chế tạo các sản phẩm của quá trình trao đổi chất (Nguyễn Hoài hương, 2009).
T. longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2, Aspergillus oryzae N2 thuộc nhóm ưa ấm
nên sinh trưởng và phát triển tốt ở 28-320C. Do đó, hoạt động sinh tổng hợp enzyme cũng thích hợp ở khoảng nhiệt độ này (Nguyễn Hữu Quân, 2009).
Nghiên cứu Sandu D.K và Kalra M.K. (1985) về T. longibrachiatum cho thấy, cellulase được tạo ra nhiều nhất ở 27-280C; Aguiar (2001), khi khảo sát khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Asp. niger IZ9 nhiệt độ cho hoạt độ cellulase cao nhất là 300C với giá trị đạt 0,33 UI/ml. Nghiên cứu Trương Phước Thiên Hoàng (2007), lại cho rằng nhiệt độ cho chủng T. longibrachiatum Y5 sinh tổng hợp cellulase thích hợp là 500C với hoạt độ enzyme đạt được là 131,48 UI/ml (Trương Phước Thiên Hoàng, 2007). Tuy nhiên 280C cũng là nhiệt độ để chủng Aspergilllus oryzae N2 sinh tổng hợp cellulase cao nhất (Nguyễn Hữu Quân, 2009). Ba chủng Trichoderma longibrachiatm, Asp. niger và S. cerevisae có nhiệt độ tối ưu là 450C (Omojasola P và Jilani O, 2008).
Như vậy nhiệt độ tối ưu để chủng T. longibrachiatum Y5, Aspergillus oryzae N2 sinh tổng hợp cellulase là 280C và Aspergillusniger T2 là 300C. Chúng tôi cũng chọn nhiệt độ này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
c) Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2.
Tiến hành nuôi cấy chủng Trichoderma longibrachiatum Y5 ở thời gian 144 giờ, nhiệt độ 280C; Aspergillus niger T2 thời gian 144 giờ, nhiệt độ 300C và Aspergillus oryzae N2 thời gian 156 giờ, nhiệt độ 280C với pH thay đổi khác nhau là 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6 và 6,5.
Hình 2.7. Đồ thị về sự biến thiên hoạt độ cellulase của chủng Trichoderma
longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2 theo pH
Đồ thị ở hình 2.7 cho thấy rằng ứng với các giá trị pH khác nhau sẽ cho các hoạt độ cellulase khác nhau.
Chúng tôi nhận thấy khoảng pH= 4,5-5,5 là giá trị pH thích hợp cho các chủng vi nấm và sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp cellulase. Trong đó chủng Trichoderma
longibrachiatum Y5 đạt cực đại tại pH= 5,5 với hoạt độ là 414,21 UI/ml. Aspergillus niger T2
cho hoạt độ enzyme cao hơn là 459,32 UI/ml tại pH= 4,5. Chủng Aspergillus oryzae N2 cho hoạt độ enzyme 341,51 UI tại pH= 5.
So sánh giữa các chủng vi nấm chúng tôi nhận thấy tại các giá trị pH tối ưu thì hoạt độ cellulase chủng Aspergillus niger T2 cao nhất và cao gấp 1,11 lần so với chủng Trichoderma
longibrachiatum Y5 và gấp 1,35 lần so với chủng Aspergillus oryzae N2.
Từ kết quả thu được ở trên, chúng tôi kết luận rằng các chủng vi nấm trong quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp cellulase mạnh trong điều kiện môi trường pH acid nhẹ (pH= 4,5-5,5) điều này có thể giải thích như sau, pH môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng, tác động sâu sắc đến các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Những biến đổi dù nhỏ của các ion (H+
và OH-) trong nồng độ của chúng cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến vi sinh vật. Bên cạnh đó, hoạt tính enzyme cũng phụ thuộc vào pH của môi trường. Vì vậy, trong thời gian nuôi cấy vi sinh vật sinh cellulase, việc xác định pH ban đầu và duy trì pH là cần thiết. pH ảnh hưởng đến sự tích điện qua màng của tế bào nên ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất qua màng, tức là ảnh hưởng đến việc sản sinh enzyme. pH thích hợp sẽ kích thích quá trình trao đổi chất tốt, do đó mà hoạt lực enzyme mạnh (Lê Hồng Phú, 2003; Trần Thạnh Phong, 2004).
Nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với công bố của một số tác giả trên thế giới như Sandu D.K và Kalra M.K (1985), chủng Trichoderma longibrachiatum cho hoạt độ cellulase tối ưu tại pH= 5-5,5. Theo nghiên cứu Omojasola P.F và Jilani O. P (2008), khi nghiên cứu trên chủng Trichoderma longibrachiatum cũng đưa ra kết quả tương tự là pH=5-6. Theo nghiên cứu Trương Phước Thiên Hoàng (2000), chủng Trichoderma thích hợp trong khoảng pH= 4,5–5. Kết quả của Acharay và cs (2008) cho rằng chủng Aspergillus niger tổng hợp cellulase mạnh nhất trong điều kiện pH= 4,5 với hoạt độ là 0,1813 UI/ml. So sánh với một số tác giả khác (Nguyễn Hữu Quân, 2009) với Aspergillus oryzaeVTCC-F-045 thì kết quả cho thấy pH thích hợp để chủng này sinh tổng hợp cellulase cao nhất là 5,5 và đạt giá trị là 35,7 UI/ml.
Như vậy pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của Trichoderma
longibrachiatum Y5 là 5,5; Aspergillus niger T2 là 4,5 và Aspergillus oryzae N2 là 5. Giá trị
pH này được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
d) Ảnh hưởng của nồng độ carbon đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2.
Cơ chất cảm ứng đóng vai trò là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp một loại enzyme tương ứng. Khi sử dụng CMC vào môi trường nuôi cấy sẽ tác động mạnh đến sinh trưởng và tổng hợp cellulase.
Chủng Trichoderma longibrachiatum Y5 thời gian nuôi cấy 144 giờ, nhiệt độ 280C và pH= 5,5; Aspergillus niger T2 thời gian nuôi cấy 144 giờ, nhiệt độ 300C và pH= 4,5 và
Aspergillus oryzae N2 thời gian nuôi cấy 156 giờ, nhiệt độ 280C và pH= 5,5; nhưng có sự thay đổi nồng độ CMC như sau: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 và 3 %.
Hình 2.8. Đồ thị về sự biến thiên hoạt độ cellulase của chủng Trichoderma
Từ đồ thị ở hình 2.8. cho thấy cơ chất CMC ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tạo cellulase của chủng vi nấm.
Trong tất cả các nồng độ CMC khảo sát, ở nồng độ CMC 1% thì hoạt độ cellulase của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5 và Aspergillus oryzae N2 đạt cực đại với giá trị lần lượt là 431,62 UI/ml và 422,13 UI/ml. Tuy nhiên đối với chủng Aspergillus niger T2 thì nồng độ CMC 1,5% cho hoạt độ cellulase cực đại là 469,78 UI/ml. So sánh khả năng sinh cellulase giữa các chủng vi nấm chúng tôi nhận thấy hoạt độ cellulase của chủng Aspergillus niger T2 là cao nhất cao gấp 1,08 lần so với chủng Trichoderma longibrachiatum Y5 và gấp 1,11 lần so với chủng Aspergillus oryzae N2.
Khi tăng nồng độ CMC hoạt độ cellulase tăng. Tuy nhiên, kết quả trên cho thấy, tiếp tục tăng nồng độ CMC đến một mức nào đó thì hoạt độ enzyme gần như ổn định và giảm nhẹ. Dung dịch CMC là một dung dịch có độ nhớt, khi tăng nồng độ CMC thì độ nhớt cũng tăng theo, do đó làm ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme vì chúng làm giảm sự linh động kết hợp giữa phức chất enzyme-cơ chất, dẫn đến hoạt độ enzyme giảm (Nguyễn Hoài Hương, 2009). Hơn nữa, sự tổng hợp enzyme còn phụ thuộc vào khả năng tiết tối đa của từng loài vi sinh vật có nghĩa là nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thì hoạt độ enzyme sẽ giảm do hai nguyên nhân, thứ nhất là do cơ chất tạo áp lực làm giảm quá trình sinh tổng hợp, thứ hai là do cơ chất tăng trong khi năng lực tiết enzyme tối đa không đổi dẫn đến làm hoạt tính enzyme giảm.
So sánh với các kết quả nghiên cứu khác như Trương Phước Thiên Hoàng (2007), sử dụng CMC làm cơ chất cảm ứng cho Trichoderma longibrachiatum sinh tổng hợp cellulase và cho kết quả cao nhất tại nồng độ CMC 0,5% và chủng T. harzianum ở nồng độ 1%. Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Quân (2009), khi khảo sát ở chủng Aspergillus oryzae VTCC-F-045 cũng có kết quả tương tự và tác giả đã cho rằng với nồng độ 1% CMC enzyme được cảm ứng sinh ra đủ để thủy phân các cao phân tử trong môi trường và cơ chất cho sự sinh trưởng của tế bào.
Dựa vào kết quả thu được từ những nghiên cứu trên chúng tôi tiến hành lựa chọn nồng độ CMC tối thích của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus oryzae N2 sinh tổng hợp cellulase là 1% và Aspergillus niger T2 là 1,5% để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
e). Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2.
Thí nghiệm được thực hiện ở thời gian nuôi cấy T. longibrachiatum Y5 144 giờ, nhiệt độ 28 0C, pH= 5 và nồng độ CMC 1%. Asp. niger T2 thời gian nuôi cấy 144 giờ, nhiệt độ 30 0C và pH= 4,5, CMC 1,5%. Asp. oryzae N2 thời gian nuôi cấy 156 giờ, nhiệt độ 28 0C và pH= 5,5, CMC 1%;
Có sự thay đổi nồng độ NaNO3 là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5%. Khảo sát ảnh hưởng của nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng vi nấm.
Hình 2.9. Đồ thị về sự biến thiên hoạt độ cellulase của chủng Trichoderma
longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2 theo nồng độ NaNO3
Từ đồ thị hình 2.9 cho thấy sự biến thiên hoạt độ enzyme theo nồng độ NaNO3 rất lớn. Đối với chủng Trichoderma longibrachiatum Y5 cho hoạt độ cellulase cao nhất là 445,87 UI/ml tại nồng độ NaNO3 là 0,4% còn Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2 đều cho