vi sinh Bokashi-Trichoderma
Phân HCVS Bokashi-Trichoderm có hàm lượng dinh dưỡng 2,5% N - 5,0% P2O5- 3,0% K2O và Trichoderma sp. 107cfu/g; Phân HCVS Quế Lâm (đối chứng 2) có hàm lượng dinh dưỡng 3% N - 2% P2O5 - 1,1% K2O. Thí nghiệm được bố trí trên giống hồ tiêu Vĩnh Linh
Thí nghiệm được bố trí từ tháng 10/2012 đến tháng 7/2013 tại Cam Nghĩa, Cam Lộ, Quảng Trị trên vườn hồ tiêu kinh doanh 7 năm tuổi.
Thí nghiệm gồm 3 công thức: bón phân HCVS Bokashi-Trichoderma; bón phân HCVS Quế Lâm (đối chứng 2); đối chứng 1 (không bón phân hữu cơ vi vi sinh). Với 15 cây/ô thí nghiệm cơ sở và được bố trí theo phương pháp khối hoàn toàn ngẫu nhiên RCBD với ba lần nhắc lại.
Phân HCVS Bokashi-Trichoderma và phân HCVS Quế Lâm được bón vào tháng 10 và tháng 12/2012 với lượng bón 2 kg/gốc hồ tiêu.
Phương pháp phân lập và xác định mật độ tuyến trùng: Phân lập và xác định mật số tuyến trùng từ đất, rễ vào 2 thời điểm tháng 2 và tháng 5/2013. Mẫu đất và mẫu rễ được đựng trong các túi nilon riêng biệt có ghi rõ thời gian và địa điểm lấy mẫu. Trộn đều các mẫu ở mỗi thời điểm và bình quân lấy 1 g rễ và 100 g đất để phân lập tuyến trùng. Mẫu rễ được rửa sạch.
Mẫu đất: Mỗi công thức lấy 5 mẫu, mỗi mẫu 100 g đất ở độ sâu 15 - 20 cm, cách gốc 20 - 30 cm, lấy theo 4 phía xung quanh gốc hồ tiêu.
Mẫu rễ: Mỗi công thức lấy 5 mẫu, mỗi mẫu 1 g rễ tơ và tươi, lấy theo bốn phía đối diện quanh rễ tiêu.
Tách lọc tuyến trùng từ mẫu rễ và đất theo phương pháp phễu lọc của Bearmann và phương pháp rây lọc (Speiger và Waele D., 1997) có cải tiến. Tiến hành rây lọc mẫu đất và rễ rồi làm tiêu bản soi dưới kính hiển vi để tính mật số tuyến trùng, rây lọc mẫu đất dùng rây có kích thước lỗ rây 200 lỗ/2,54 cm2 và lọc mẫu rễ dùng rây có kích thước lỗ rây 80 lỗ/2,54 cm2
và 200 lỗ/2,54 cm2 theo Agrios (2004).
Định danh giống tuyến trùng theo phương pháp của Luc và cs. (2005) và đếm tuyến trùng theo phương pháp của Babieva và Gorin (1987)
- Các chỉ tiêu theo dõi: Số nốt sưng trên một đơn vị chiều dài rễ; Số nốt sưng/g rễ; Mật số tuyến trùng Meloidogyne spp/100 g đất; Mật số tuyến trùng Meloidogyne spp/g rễ; Các yếu tố cầu thành năng suất và năng suất.
1.6.3.5. Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu* Vật liệu : Vườn Hồ Tiêu kinh doanh 5 - 7 năm tuổi. * Vật liệu : Vườn Hồ Tiêu kinh doanh 5 - 7 năm tuổi.
* Phương pháp bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức, 3 lần nhắc lại với quy mô mỗi ô thí nghiệm 10 trụ, tổng số 350 trụ (150 trụ thí nghiệm, 200 trụ bảo vệ) bằng phương pháp khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCBD)
- CT1 : Không áp dụng biện pháp phòng trừ (đối chứng 1)
- CT2: Theo quy trình của người dân (đối chứng 2): tưới dung dịch Booc-đô 1% 1 lần vào gốc vào đầu mùa mưa
- CT3 : Dùng Ridomil 68WG (nhóm Metalaxyl): tưới vào gốc nồng độ 0,2% , 3 L dung dịch/gốc/lần tưới, 3 lần cách nhau 15 ngày
- CT4 : Dùng Agri-Fos 400 (gốc phosphonate): (kết hợp vừa tưới vào gốc 4ml thuốc + 4 L nước/lần, vừa phun lên lá) 15 ngày xử lý 1 lần, xử lý 3 lần (đầu mùa mưa)
+ Dùng để phun nồng độ 0,1% phun ướt đẫm đều trên toàn bộ tán lá +Tưới vào gốc: nồng độ 0,5%, liều lượng 1 L dung dịch/ gốc
- CT5 : Dùng chế phẩm Pseudomonas: 20g/2 L nước/gốc/lần tưới, 30 ngày tưới 1 lần, tưới 3 lần (đầu mùa mưa )
* Chăm sóc: làm cỏ, bón phân, tưới nước theo quy trình chung, phòng trừ sâu bệnh theo quy
trình riêng.
* Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi :
a- Tỷ lệ bệnh (%)
Theo dõi bằng cách đếm số cành trên mỗi gốc và số cành bị bệnh trên mỗi gốc. Tỷ lệ bệnh (%) = Số dây bị bệnh / tổng số dây * 100%
Đếm và phân cấp bệnh của các gốc theo bảng phân cấp: Cấp 0: cây không nhiễm bệnh.
Cấp 1: Có 1-2 cành, lá ở trên ngọn bị rũ xuống. Cấp 3: Có 3-5 cành, lá ở trên ngọn bị rũ xuống.
Cấp 5: Có trên 5 dây bị rũ xuống và lá trên dây trở thành màu nâu. Cấp 7: Toàn bộ dây bị rũ, lá mất nước chuyển thành màu vàng. Cấp 9: Toàn cây vàng, khô chết.
Chỉ số bệnh (%) = (N1×1 + N3×3 + … + N9 × 9) × 100 / (N× 9) N1: số cây nhiễm cấp 1
N : tổng số cây điều tra * Ghi chú:
Các lần quan trắc tiến hành trong mùa mưa (mùa cao điểm phát sinh, phát triễn bệnh); chu kỳ quan trắc là 15 ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Đánh giá tỷ lệ bệnh trên từng công thức trước xử lý
- Đánh giá chỉ số bệnh trên từng công thức trước và sau khi xử lý
* Xử lý số liệu: bằng các phần mềm Exel, statistic 9.0 1.6.3.6. Nuôi cấy in vitro cây hồ tiêu
Điều kiện và môi trường nuôi cấy
Mẫu được cấy lên các môi trường ½ MS, MS, SH có bổ sung sucrose (30 g/l đối với môi trường MS, 10 g/l đối với môi trường SH), 8 g/l agar và các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin với nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh đến pH 5,8; khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút, áp suất 1 atm.
Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 2°C, cường độ chiếu sáng 2.000-3.000 lux, thời gian chiếu sáng 14-16 giờ/ngày.
Nghiên cứu tạo vật liệu ban đầu
Chuẩn bị và khử trùng mẫu
a) Đối với hạt hồ tiêu
Chọn hạt tiêu đã chín, bóc vỏ lấy sọ. Sau khi bóc vỏ, hạt được rửa sạch dưới vòi nước 15 phút, ngâm trong xà phòng diệt khuẩn loãng trong 60 phút, rồi ngâm trong dung dịch Javel 40% trong 30 phút. Sau đó, rửa hạt nhiều lần dưới vòi nước máy và cho vào bình tam giác sạch, đậy nắp bằng giấy nhôm rồi đưa vào tủ cấy vô trùng để tiếp tục khử trùng.
Hạt được ngâm trong cồn 700 trong 60 giây, rửa lại bằng nước cất vô trùng. Tiếp tục khử trùng hạt bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô
b) Đối với dây tiêu
Dây tiêu với kích thước từ 5 - 7 đốt thu từ các hom tiêu được cắt thành từng đoạn với mỗi đoạn là một mắt đốt có cuống lá. Mẫu được rửa sạch dưới vòi nước rồi ngâm trong dung dịch xà phòng diệt khuẩn loãng trong 60 phút. Sau khi rửa sạch xà phòng dưới vòi nước có thể kết hợp ngâm trong dung dịch thuốc diệt nấm Tricyclazol (330 g/l, pha loãng 10-15 ml). Các đốt tiêu được cho vào bình tam giác sạch, đậy nắp bằng giấy nhôm rồi đưa vào tủ cấy vô trùng để tiếp tục khử trùng.
Các đốt tiêu được ngâm trong cồn 700 trong 45 giây, rửa lại bằng nước cất vô trùng. Sau đó tiếp tục ngâm mẫu với dung dịch HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian khác nhau để nghiên cứu hiệu quả khử trùng. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 - 6 lần, tiến hành thu đoạn thân non, cuống lá, mắt đốt làm nguồn mẫu vật để cấy.
Nghiên cứu khả năng tạo callus của hồ tiêu
Sau khi khử trùng, mẫu hồ tiêu (hạt, lá có kích thước 0,5 cm × 1,0 cm; cuống lá dài 1 cm; đoạn thân dài 1 cm được chẻ dọc theo chiều dài thân) được cấy lên môi trường cơ bản MS chứa 3,0% saccharose, 0,8% agar có bổ sung BAP kết hợp với IBA hoặc BAP kết hợp với 2,4-D để thăm dò khả năng tạo callus. Số liệu nghiên cứu được thu sau 8 tuần nuôi cấy.
Nghiên cứu khả năng tạo chồi
Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ đoạn mắt đốt tự nhiên
Đoạn mắt đốt tự nhiên sau khi khử trùng được cấy lên môi trường cơ bản MS chứa 3,0% saccharose, 0,8% agar và bổ sung riêng lẻ BAP hoặc Kin hoặc BAP kết hợp với IBA ở các nồng độ khác nhau để nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ đoạn mắt đốt. Số liệu nghiên cứu được thu sau 8 tuần nuôi cấy.
Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ callus
Callus có nguồn gốc từ hạt và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy được chuyển sang môi trường cơ bản MS chứa 3,0% saccharose, 0,8% agar và bổ sung BAP kết hợp với Kin và IBA hoặc BAP kết hợp với TDZ ở các nồng độ khác nhau để nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ callus có nguồn gốc từ đoạn thân và từ hạt. Số liệu nghiên cứu được thu sau 8 tuần nuôi cấy.
Nhân chồi
Các chồi tái sinh thu được từ giai đoạn nuôi cấy khởi đầu sẽ được cắt thành các đốt dài khoảng 1,0 - 1,5 cm. Mỗi đốt được cấy lên môi trường cơ bản MS có bổ sung riêng lẻ hay tổ hợp BAP, Kin và IBA để thăm dò khả năng tạo cụm chồi.
Tạo rễ
Chồi in vitro thu được từ các thí nghiệm trên, được cấy lên môi trường ½ MS có bổ sung NAA (0,1 - 1,0 mg/l) để thăm dò khả năng hình thành và phát triển của rễ.
Kiểm tra sạch virus
Các chồi hồ tiêu tái sinh từ callus của các dòng hồ tiêu có nguồn gốc ban đầu từ hạt được tiến hành kiểm tra virus PYMoV bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) trước khi cấy chuyền sang môi trường nhân chồi.
- Lấy 0,5 g mẫu lá từ chồi in vitro cho vào cối sứ, thêm 3 ml dịch chiết và 0,3 ml Sakozyl 10%. Tiến hành nghiền, sau đó lấy 1,5 ml dịch nghiền cho vào tube eppendorf 2,0 ml. Ủ ở 55°C trong 1 - 2 giờ.
- Ly tâm dịch chiết với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trên tủa (0,8 ml) cho vào tube eppendoft khác. Bổ sung 100 µl dung dịch 5 M NaCl và 100 µl CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 0,7 M để loại bỏ carbamat và làm mỏng màng tế bào tạo điều kiện tốt cho việc thu DNA. Ủ ở 65°C trong 10 phút.
- Cho 0,6 ml Chloroform/Isoamylalcohol (24/1) vào lắc mạnh, ly tâm 11.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Lấy dịch trên tủa (0,8 ml) cho sang tube eppendorf mới. Bổ sung 0,6 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25/24/1), lắc mạnh, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Lấy dịch trên tủa (0,6 ml) cho vào eppendorf mới rồi thêm 360 µl isopropanol, lắc nhẹ, giữ ở -20°C trong 2 giờ hoặc qua đêm.
- Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 20 phút. Loại bỏ dịch trên tủa, thu lấy kết tủa. Rửa kết tủa bằng ethanol 70% rồi làm khô bằng máy hút chân không.
- Hòa tan kết tủa bằng 100 µl dung dich đệm TE pH 8,0 và bảo quản dịch DNA ở -20°C dùng làm khuôn mẫu.
Phản ứng PCR
Sau khi tách chiết DNA tổng số, trình tự bộ gen của PYMoV được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chung Badnavirus (bảng 2.2) của TS. Hà Viết Cường (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) thiết kế, sản phẩm có kích thước 600 bp.
Thành phần phản ứng PCR trong 1 tube bao gồm: 2,5 µl PCR buffer, 1 µl dNTPs, 1 µl mồi xuôi BadF, 1 µl mồi ngược BadR, 0,5 µl Dream Taq, 1 µl DNA tổng số và 18 µl nước cất 2 lần đã khử trùng. Phản ứng được thực hiện trong máy luân nhiệt theo quy trình: biến tính genome 94ºC/4 phút; tiếp đến là 35 chu kỳ: 94ºC/40 giây, 55ºC/40 giây và 72ºC/1 phút và cuối cùng là 72ºC/5 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,4% với 2 µl thuốc nhuộm ethydium bromide (EtBr). Chạy điện di trong dung dung dịch đệm TAE. Dựa vào thang chuẩn marker (1 kb) và mẫu đối chứng để kiểm tra kết quả.
Bảng 1.8. Cặp mồi dùng để khuếch đại PYMoV trong phản ứng PCR Tên mồi Trình tự (5’ ………… 3’) Kích thước sản phẩm dự kiến (bp) Nguồn
Badna Rev TTCCACTTACAiACiCCiCCC 600
TS. Hà Viết Cường, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Badna For ATGCCiTTCGGiCTiAAAAACGCiCC
Ghi chú: i là inosine
1.6.3.7. Phương pháp nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu
Bố trí thí nghiệm
- Công thức thí nghiệm : 5 công thức 3 lần nhắc lại. Quy mô :
+ Mỗi ô thí nghiệm 10 trụ, tổng số 350 trụ (150 trụ thí nghiệm, 200 trụ bảo vệ). - Phương pháp bố trí thí nghiệm : Khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCBD)
Chăm sóc: làm cỏ, bón phân, tưới nước theo quy trình của Tôn Nữ Tuấn Nam (2007) Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Tiến hành điều tra hiệu quả phòng trừ bệnh của các công thức thí nghiệm thông qua 2 chỉ tiêu là tỷ lệ bệnh (%), chỉ số bệnh (%).
a- Tỷ lệ bệnh (%)
Theo dõi bằng cách đếm số cành trên mỗi gốc và số cành bị bệnh trên mỗi gốc. Tỷ lệ bệnh (%) = Số dây bị bệnh / tổng số dây * 100%
b- Chỉ số bệnh (%)
Đếm và phân cấp bệnh của các gốc theo bảng phân cấp: Cấp 0: cây không nhiễm bệnh.
Cấp 1: Có 1-2 cành, lá ở trên ngọn bị rũ xuống. Cấp 3: Có 3-5 cành, lá ở trên ngọn bị rũ xuống.
Cấp 5: Có trên 5 dây bị rũ xuống và lá trên dây trở thành màu nâu. Cấp 7: Toàn bộ dây bị rũ, lá mất nước chuyển thành màu vàng. Cấp 9: Toàn cây vàng, khô chết.
Chỉ số bệnh (%) = (N1×1 + N3×3 + … + N9×9) x 100 / (N×9) N1: số cây nhiễm cấp 1
N : tổng số cây điều tra * Ghi chú:
Các lần quan trắc tiến hành trong mùa mưa (mùa cao điểm phát sinh, phát triễn bệnh); chu kỳ quan trắc là 15 ngày.
1.6.3.8. Nghiên cứu phương pháp thu hoạch, phơi sấy, phân loại và bảo quản hồ tiêu
- Chọn mẫu: tại tỉnh Quảng Trị, vùng trồng tiêu nhiều chủ yếu tập trung tại 2 huyện là Vĩnh Linh và Cam Lộ, trong mỗi huyện lấy thí điểm 2 xã trồng tiêu chủ lực, trong mỗi xã tiến hành chọn ngẫu nhiên 15 mẫu để điều tra và đánh giá.
- Lập bảng hỏi: xây dựng bảng hỏi cấu trúc và bán cấu trúc nhằm khẳng định lại các dữ liệu về thực trạng sau thu hoạch tiêu tại tỉnh, đồng thời đặt ra những câu hỏi tại chỗ để thu thập ý kiến mới nhằm đưa ra những giải pháp để cải thiện thực trạng hiện tại.
1.6.3.9. Nghiên cứu qui trình chế biến tiêu đenSơ đồ bố trí thí nghiệm Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Sơ đồ 1.1. Bố trí thí nghiệm
Lấy mẫu
Mẫu A Mẫu B Mẫu C
Đánh giá chỉ tiêu ban đầu
- Độ cứng - Kích thước - Dung trọng - Màu sắc - Tỷ lệ hạt lép, hạt non - Độ cứng - Kích thước - Dung trọng - Màu sắc - Tỷ lệ hạt lép, hạt non Chế biến Sản phẩm tiêu đen tiêu đen Sản phẩm tiêu sọ tiêu sọ Đánh giá chất lượng - Tro tổng số - Tinh dầu bay hơi - Piperine
- Tinh dầu bay hơi
- Piperine
- Độ sáng - Tro tổng số - Tinh dầu bay hơi - Piperine
- Độ sáng - Tro tổng số - Tinh dầu bay hơi
Thuyết minh sơ đồ
* Phương pháp lấy mẫu tiêu
Tiêu sau khi thu hoạch ở các vườn với độ chín khác nhau, làm sạch sơ bộ, loại bỏ dé, cành lá và tiến hành lấy mẫu với 3 mẫu tiêu với độ chín tăng dần (sơ đồ I) bao gồm:
- Mẫu A: là mẫu tiêu bao gồm chủ yếu các hạt tiêu xanh (tỷ lệ độ chín từ 0-5%)
- Mẫu B: là mẫu tiêu lấy một cách ngẫu nhiên từ các mẫu tiêu ban đầu (tỷ lệ độ chín từ 15-20%)
- Mẫu C: là mẫu tiêu được chọn từ vườn có độ chín cao phối trộn với tiêu chín nhặt ra từ các mẫu ban đầu khác (tỷ lệ độ chín từ 35-40%)
Mỗi mẫu tiêu lấy 3 lần lặp lại. Tiến hành đánh giá các chỉ tiêu ban đầu của các mẫu nguyên liệu.
Đối với mẫu nguyên liệu tiêu dùng cho chế biến tiêu sọ: Mỗi mẫu tiêu tiến hành lấy 30 mẫu nhỏ với khối lượng 100 g/mẫu. Mỗi mẫu tiến hành khảo sát quá trình bóc vỏ trong 10 ngày, lặp lại 3 lần/mẫu/ngày.
Phương pháp xác định các chỉ tiêu ban đầu của hạt tiêu
Độ cứng của hạt tiêu
Độ cứng của hạt tiêu (N) được đo trên máy đo độ cứng DFS- Digital Force Gauge.