Phương pháp đếm bào tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men, nấm mốc.
Cách đếm: Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu bằng máy vortex. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào mặt trên buồng đếm. Chú ý không để thành bọt khí hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh sau đó đậy lam kính lên. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử trong 5 ô lớn chéo nhau. Trong một ô lớn đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con 16.
Tính số lượng bào tử theo công thức:
n a
N =0,25× ×106×10 (tế bào/ml) N: Số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù.
a: Số lượng bào tử bình quân trong một ô lớn. n: Độ pha loãng mẫu.
Phương pháp nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp cellulase (Blandino A. et al, 2001)
Môi trường sinh tổng hợp cellulase đựng trong các bình tam giác 250 ml được hấp khử trùng và để nguội.
Chủng Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2 và Aspergillus oryzae N2 được cấy vào các bình tam giác sao cho đạt mật độ 5×106 bào tử/ml môi trường. Sau đó tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ tối ưu.
Phương pháp hóa lý
a) Xác định hoạt độ cellulase bằng phương pháp so màu với thuốc thử DNS (Lê Hồng Phú, 2003)
* Nguyên tắc
Để xác định hoạt tính cellulase, ta cần sử dụng CMC như cơ chất, ủ dịch chiết enzyme trong 30 phút, pH= 5 ở nhiệt độ 500C. Hệ enzyme sẽ tác dụng lên CMC giải phóng các phân tử glucose. Dựa vào hàm lượng glucose được giải phóng ra để xác định hoạt độ cellulase.
• Cách tiến hành
- Đối với mẫu thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm 200 µl dung dịch enzyme và 200 µl dung dịch CMC 1% pha trong đệm phosphat 0,1M, pH= 5. Lắc đều, ủ ở 500C trong 30 phút. Sau đó thêm 400 µl DNS trộn đều, đun sôi cách thủy 10 phút và làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng. Đo ở bước sóng 540 nm.
- Đối với mẫu đối chứng: Cho vào ống nghiệm 200 µl dung dịch enzyme và 400 µl DNS. Thêm dung dịch 200 µl CMC 1% pha trong dung dịch đệm phosphat 0,1M, pH= 5. Lắc đều ủ ở 500C trong 30 phút. Trộn đều, đun sôi cách thủy 10 phút, làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng. Đo ở bước sóng 540 nm.
• Cách tính
Đơn vị hoạt độ cellulase được xác định như sau: một đơn vị hoạt độ tương ứng với 1µg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất 30 phút ở nhiệt độ 500C.
Hđ cellulase (UI/ml) = t v n x × × × 18 , 0 Trong đó:
Hđcellulose : Hoạt độ cellulase (UI/ml) x : Hàm lượng glucose (µg/ml) v : Thể tích enzyme phản ứng (ml) t : Thời gian phản ứng (phút) n : Hệ số pha loãng
Phương pháp định lượng đường khử bằng acid dinitro–salicylic (DNS): Phương pháp Miller (Miller G.L., 1959)
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3-5 dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng 540 nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và acid DNS:
∗Cách tiến hành
Dựng đồ thị chuẩn glucose: Từ dung dịch glucose chuẩn (0,5 mg/ml), pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 0,1- 0,5 (mg/ml).
Cho 0,5 ml dung dịch glucose chuẩn vào các ống nghiệm sạch, khô thêm vào 0,5 ml thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Thêm vào 5 ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với ống đối chứng là nước cất.
Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang ở bước sóng 540 nm (OD540nm), trục hoành là nồng độ glucose (mg/ml) (Phần phụ lục).
Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Khảo sát thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
Chuẩn bị môi trường sinh tổng hợp cellulase để nuôi cấy chủng vi nấm. Tiến hành nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở pH 6,5 và nhiệt độ 290C trong 168 giờ. Tại các thời điểm nuôi cấy 12 -168 giờ (cách nhau 12 giờ) thu lấy dịch enzyme thô để tính hoạt độ cellulase và xác định sự biến thiên của hoạt độ.
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
Chuẩn bị môi trường sinh tổng hợp cellulase để nuôi cấy loài nấm mốc. Tiến hành nuôi cấy lắc 180 vòng/phút và pH 6,5 ở các nhiệt độ 240C, 260C, 280C, 300C, 320C, 340C và 360C. Thời gian nuôi cấy là thời gian tối ưu xác định ở trên. Tại mỗi nhiệt độ thu lấy dịch enzyme thô để xác định hoạt độ cellulase.
OH O2N NO 2 O OH O OH R + + 3 OH H 2N NO2 O OH R O H H2O +
- Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
Chủng Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2, Aspergillus oryzae N2 được nuôi cấy lắc 180 vòng/phút trong môi trường có pH thay đổi tương ứng là 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6 và 6,5. Tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ tối ưu và thời gian nuôi cấy thích hợp đã xác định ở trên. Tại mỗi giá trị pH, chúng tôi thu lấy dịch enzyme thô để xác định hoạt tính cellulase.
- Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
+ Ảnh hưởng của nồng độ carbon
Chủng vi nấm Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2, Aspergillus
oryzae N2 được nuôi cấy với pH, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy tối ưu đã xác định ở
trên.
Thành phần CMC (carboxyl methyl cellulose) trong môi trường nuôi cấy được thay đổi với các nồng độ khác nhau 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 và 3 %. Tại mỗi nồng độ, dịch enzyme thô thu được dùng để xác định hoạt tính.
+ Tối ưu nguồn nitrogen
Chủng vi nấm Trichoderma longibrachiatum Y5, Aspergillus niger T2, Aspergillus
oryzae N2 được nuôi cấy với pH, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy tối ưu đã xác định ở
trên.
Thành phần NaNO3 được thay đối nồng độ khác nhau như 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 %. Thu lấy dịch enzyme thô và xác định hoạt tính.
- Ứng dụng khả năng sinh tổng hợp cellualase xử lý vỏ tiêu
Chủng vi nấm được nuôi cấy trong môi trường Czapek với các điều kiện nuôi cấy tối ưu đã được xác định để thu sinh khối. Tiêu được thu hái và làm sạch. Sau đó phối trộn sinh khối nấm vào tiêu theo tỉ lệ 2%, 4%, 6%.
1.6.3.11. Phương pháp đánh giá hiệu quả kinh tế, phân tích chuỗi cung, và mối liên kết giữa người bán - người mua