2.5.1. Tỷ lệ bệnh chết nhanh cuả các công thức trước và sau khi xử lý
Bảng 2.41. Tỷ lệ bệnh chết nhanh (%) của các công thức trước và sau khi xử lý TT Công
thức Ngày sau xử lý
0 ngày 15 ngày 30 ngày 45 ngày 60 ngày 75 ngày 90 ngày 1 I (ĐC) 20,00a 20,00a 21,00ab 23,00a 25,33a 28,33a 31,00a
2 II 20,66a 20,66a 21,66a 23,67a 25,33a 27,00a 28,00b
3 III 19,00a 19,67a 16,66cd 14,00b 7,33bc 7,33b 9,33c
4 IV 19,66a 19,66a 14,67d 12,00b 5,33c 5,33c 5,33d
5 V 20,33a 20,33a 18,33bc 14,00b 9,00b 9,00b 8,67c
Ngày từ đầu mùa mưa trước khi xử lý bệnh, tỉ lệ bệnh đã khá cao từ 19-20% và sai khác giữa các công thức không có ý nghĩa 5%. Chứng tỏ nguồn bệnh đã bắt đầu lây lan nhanh và bệnh có chiều hướng tăng dần theo thời gian, thể hiện qua số liệu của công thức đối chứng (công thức I).
Sau khi xử lý thuốc và chế phẩm sinh học 30 ngày thì hiệu lực của thuốc mới có hiệu quả rõ rệt so với đối chứng có ý nghĩa 5%, riêng công thức 2 xử lý bằng thuốc Bordeaux 1% tưới gốc 1 lần không sai khác so với đối chứng.
Sau xử lý 60 đến 90 ngày, tuy tỉ lệ bệnh của các công thức xử lý Ridomyl (CT III), Agrifos 400 (CT IV) và chế phẩm Pseudomonas (CT V) có giảm so với đối chứng và công thức 2 (xử lý Bordeaux) có ý nghĩa 5%, nhưng tỉ lệ bệnh của các công thức này hầu như không thay đổi; điều này chứng tỏ, có thể những cây còn nhiễm bệnh là những cây bị nhiễm bệnh quá nặng, thuốc không đủ tác dụng để trừ bệnh và cây không thể phục hồi.
Cuối cùng, hiệu lực phòng trừ sự lây lan xâm nhiễm của bệnh Phytophthora trên cây tiêu của thuốc Agrifos 400 cao nhất, tiếp đến là chế phẩm sinh học Pseudomonas và Ridomil, thuốc Bordeaux hiệu lực chậm và thấp nhất.
2.5.2 Chỉ số bệnh ở các công thức trước và sau khi xử lý
Bảng 2.42. Chỉ số bệnh ở các công thức trước và sau khi xử lý
TT Công thức Ngày sau xử lý
0 ngày 15 ngày 30 ngày 45 ngày 60 ngày 75 ngày 90 ngày 1 CT I (ĐC) 2,00a 1,67ab 2,00a 2,00a 1,33a 2,33a 2,67a 2 CT II 1,00b 1,00c 2,00a 1,66a 1,33a 2,00a 2,33a 3 CT III 1,33b 1,33bc 1,33a 1,00bc 0,33b 0,33b 0,67b 4 CT IV 2,00a 2,00a 1,33a 0,66c 0,00 0,00b 0,00b 5 CT V 2,00a 2,00a 1,33a 0,67c 0,00 0,33b 0,33b
Qua số liệu bảng 2.42, cho thấy:
Trước khi xử lý, chỉ số bệnh của các công thức biến động từ 1-2% (cấp bệnh trung bình giữa các công thức biến động từ cấp 0 đến cấp 1), có thể do các cây mới nhiễm bệnh vào đầu mùa mưa. Tương tự như tỉ lệ bệnh, sau 30 ngày xử lý hiệu lực của thuốc xử lý mới có hiệu quả, nhưng biểu hiện mức độ nhiễm bệnh sai khác so với đối chứng không đáng tin cậy 95%.
Từ sau 60-90 ngày xử lý, chỉ số bệnh của các công thức 4 (Agrifos 400), công thức 5 (chế phẩm Pseudomonas) và công thức III (Ridomil) có giảm có ý nghĩa 5% so với đối chứng, nhưng hầu như không thay đổi và chỉ số bệnh giữa 3 công thức sai khác không đáng kể (ý nghĩa 5%), chứng tỏ 3 sản phẩm này duy trì được mức độ bệnh hại; trong khi công thức I (đối chứng), công thức II (Bordeaux) có mức độ bệnh hại tăng và chỉ số bệnh giữa 2 công thức này sai khác không có ý nghĩa 5%.
2.6. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống in vitro cây hồ tiêu2.6.1. Ảnh hưởng của phương pháp và thời gian khử trùng mẫu 2.6.1. Ảnh hưởng của phương pháp và thời gian khử trùng mẫu
Đối với hạt
Đưa hạt vào bình tam giác sạch đã được hấp khử trùng, đậy nắp bằng giấy nhôm rồi đưa vào tủ cấy để tiếp tục khử trùng. Ngâm hạt trong cồn 700 trong 1 phút và rửa lại bằng nước cất vô trùng. Tiếp tục ngâm hạt trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút, rồi lại rửa bằng nước cất vô trùng 5-6 lần. Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường nuôi cấy để nghiên cứu khả năng tạo callus.
Sau 4 tuần gieo hạt, chúng tôi quan sát thấy tỷ lệ hạt nhiễm rất lớn, gần 70%; tỷ lệ hạt không có biểu hiện sinh trưởng (có thể chết phôi) gần 20%, hạt tạo callus là xấp xỉ 10%. Kết
quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng HgCl2 0,1% trong 10 phút cho hiệu quả khử trùng hạt tốt.
Theo Nguyễn Thị Thanh và cs (2007), hạt rửa sạch sau khi bóc vỏ được khử trùng bằng cồn 700 trong 1 phút, sau đó ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút rồi rửa với nước cất vô trùng 5-6 lần, tiếp theo ngâm hạt trong dung dịch cefotaxime 0,1% trong 1 giờ. Tỷ lệ mẫu vô trùng thu được từ 80-90%. Ở đây, các tác giả thu được tỷ lệ mẫu vô trùng cao có thể là nhờ sử dụng cefotaxime trong quá trình xử lý mẫu.
Đối với dây tiêu
Dây tiêu với kích thước từ 5 - 7 đốt được cắt từ các hom tiêu, đem cắt thành từng đoạn với mỗi đoạn là một mắt đốt có cuống lá.
Các đốt tiêu được ngâm trong cồn 700 trong 45 giây, rửa lại bằng nước cất vô trùng. Sau đó tiếp tục ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian từ 10- 15 phút sau khi lắc với thuốc diệt nấm 30 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự kết hợp với thuốc diệt nấm cho hiệu quả khử trùng cao hơn. Kết quả khử trùng tốt nhất là bằng HgCl20,1% trong 13 phút với tỷ lệ mẫu sống đạt 19,58%, tỷ lệ mẫu chết 10,86% và tỷ lệ mẫu nhiễm là 69,56%.
Trong quá trình khử trùng mẫu, Đoàn Thị Ái Thuyền và cs (2005) đã sử dụng kết hợp kháng sinh nhằm tăng hiệu quả khử trùng. Mẫu cũng được xử lý qua các bước: ngâm cồn 700, dung dịch Javel 10% trong 15 phút, dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút. Sau đó, mẫu được lắc trong dung dịch cefotaxime 0,5% trên máy lắc từ 1 - 24 giờ. Sau mỗi bước khử trùng, mẫu đều được rửa với nước cất vô trùng 3 lần. Tuy nhiên, mẫu đã qua xử lý sau 20 - 45 ngày vẫn có thể bị tái nhiễm trở lại tại những vị trí tiếp xúc với môi trường do mầm bệnh nội sinh vẫn còn trong mẫu. Để làm giảm sự tái nhiễm khuẩn của mẫu cấy, nhóm tác giả đã bổ sung thêm 0,5% cefotaxime trong môi trường nuôi cấy ban đầu. Sau đó cấy chuyển mẫu qua môi trường không có kháng sinh để tạo chồi mới. Với phương pháp này, nhóm tác giả thu được 25 - 30% mẫu sạch hoàn toàn mầm bệnh nội sinh .
Tóm lại, hồ tiêu là một loại cây trồng lâu năm nên mang nhiều mầm bệnh nội sinh. Hơn nữa, nó lại được nhân giống bằng phương pháp giâm hom, các mầm bệnh sẽ đi theo mạch dẫn của cây truyền từ cây này sang cây khác nên rất khó để khử trùng.
2.6.2. Nghiên cứu khả năng tạo callus
Nghiên cứu khả năng tạo callus của hạt hồ tiêu
Sau khi khử trùng, hạt hồ tiêu được cấy lên môi trường cơ bản MS bổ sung BAP kết hợp với IBA hoặc BAP kết hợp với 2,4-D để thăm dò khả năng tạo callus của hạt. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với IBA hoặc BAP kết hợp với 2,4-D lên khả năng tạo callus của hạt được trình bày ở bảng 2.43.
Bảng 3.43. Ảnh hưởng của các chất KTST lên khả năng tạo callus của hạt Nồng độ chất KTST (mg/l) BAP IBA 2,4-D 0 3 3 3 4 0 1 2 0 0 0 0 0 0,5 0,5 0 100 100 100 100 Không phát sinh Trắng đục, xanh, cứng Trắng đục, xanh, cứng Trắng đục, xanh, cứng Trắng đục, xanh, cứng Hạt sau khi cấy lên môi trường khoảng 2 tuần thì hạt bắt đầu tạo callus. Quan sát thấy callus hình thành ở vị trí mô noãn của hạt. Sau khoảng 4 tuần thì 100% hạt còn sống tạo callus ở tất cả các loại môi trường.
Nhìn chung hạt hồ tiêu rất dễ tạo callus. Callus hình thành trên tất cả các môi trường, tuy nhiên quan sát thấy thời gian cảm ứng callus của hạt trên môi trường BAP kết hợp với 2,4-D là nhanh hơn và sinh khối callus của hạt trên loại môi trường này là lớn hơn.Callus tạo thành trên môi trường BAP kết hợp với IBA và môi trường bổ sung BAP kết hợp với 2,4-D có hình thái không khác nhau và gần như tương đồng. Callus có màu trắng đục, xanh và khá cứng.
Sau 8 tuần nuôi cấy, chúng tôi chuyển callus qua môi trường tái sinh chồi để nghiên cứu khả năng tái sinh chồi của callus có nguồn gốc từ hạt.
Nghiên cứu khả năng tạo callus của đoạn thân
Sau khi khử trùng mắt đốt có mang đoạn thân, cắt đoạn thân non kích thước khoảng 1 - 2 cm sau đó cắt dọc, tạo vết thương lên đoạn thân hoặc cắt lát mỏng. Cấy mẫu lên môi trường cơ bản MS chứa 3,0% saccharose, 0,8% agar và bổ sung BAP kết hợp với IBA hoặc BAP kết hợp với 2,4-D để thăm dò khả năng tạo callus của đoạn thân. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với IBA hoặc BAP kết hợp với 2,4-D lên khả năng tạo callus của đoạn thân được trình bày ở bảng 2.44.
Bảng 2.44. Ảnh hưởng của các chất KTST lên khả năng tạo callus của đoạn thân Nồng độ chất KTST (mg/l) BAP IBA 2,4-D 0 3 3 3 4 0 1 2 0 0 0 0 0 0,5 0,5 0 100 100 100 100 Không phát sinh Vàng xanh, cứng Vàng xanh, cứng Vàng xanh, cứng Vàng xanh, cứng
Đoạn thân non sau khi cấy lên trên môi trường khoảng 2 tuần thì bắt đầu cảm ứng tạo callus. Trong đó, mẫu cắt lát mỏng cảm ứng tạo callus trong thời gian ngắn nhất (khoảng 10 ngày), tiếp theo là mẫu được cắt dọc và cuối cùng là đoạn thân giữ nguyên và
được tạo vết thương. Nguyên nhân là do khả năng ảnh hưởng của kích thước mẫu vật; mẫu vật càng nhỏ thì khả năng cảm ứng callus càng nhanh do nó có thể tiếp xúc gần như hoàn toàn với môi trường nuôi cấy. Đối với đoạn thân non thì môi trường BAP kết hợp với 2,4- D cho thời gian cảm ứng callus nhanh hơn; trung bình khoảng 12 ngày đã thấy có sự cảm ứng tạo callus. Sinh khối callus của đoạn thân nuôi cấy trên môi trường bổ sung BAP và IBA cũng không khác biệt so với trên môi trường bổ sung BAP kết hợp 2,4-D. Callus tạo thành từ đoạn thân non có màu vàng, pha xanh và khá cứng.
Sau 8 tuần nuôi cấy chúng tôi tiến hành chuyển callus qua môi trường tái sinh chồi để nghiên cứu khả năng tái sinh chồi của callus có nguồn gốc từ đoạn thân.
Nghiên cứu khả năng tạo callus của cuống lá
Sau khi khử trùng, cuống lá được cắt thành từng đoạn với kích thước dài khoảng 1 cm. Cấy mẫu lên môi trường cơ bản MS chứa 3,0% saccharose, 0,8% agar và bổ sung BAP kết hợp với IBA hoặc BAP kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau để thăm dò khả năng tạo callus của cuống lá. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus từ cuống lá được thể hiện qua bảng 2.45.
Bảng 2.45. Ảnh hưởng của các chất KTST lên khả năng tạo callus của cuống lá Nồng độ chất KTST (mg/l) BAP IBA 2,4-D 0 3 3 3 4 0 1 2 0 0 0 0 0 0,5 0,5 0 100 100 100 100 Không phát sinh Trắng ngà, mềm Trắng ngà, mềm Trắng ngà, mềm, ướt Trắng ngà, mềm, ướt Cuống lá sau khi cấy lên môi trường khoảng 2 tuần thì bắt đầu cảm ứng tạo callus. Callus hình thành ở tất cả các môi trường có bổ sung chất KTST và bắt đầu phát triển mạnh kể từ tuần thứ 3. Ở tất cả các môi trường nghiên cứu, sinh khối callus phát triển gần như giống nhau; tất cả đều có màu trắng ngà và mềm. Riêng đối với môi trường bổ sung BAP kết hợp 2,4-D thì khối callus có ướt hơn. So với callus hình thành từ hạt và từ đoạn thân thì callus hình thành từ cuống lá có tốc độ phát triển nhanh hơn, cho sinh khối lớn hơn trong cùng khoảng thời gian nuôi cấy.
Các khối callus hình thành từ cuống là rất khó hay thậm chí là không có khả năng tái sinh chồi do đó chúng tôi không tiếp tục sử dụng chúng để đưa vào nghiên cứu tạo chồi. Tuy nhiên, Ahmad và cs (2011) đã tái sinh chồi thành công từ callus có nguồn gốc từ cuống lá. Sự khác biệt này có thể là do môi trường tạo callus mà các tác giả sử dụng (BAP) khác với môi trường mà chúng tôi sử dụng (BAP kết hợp với IBA hoặc 2,4-D) dẫn đến hình thành các loại callus khác nhau.
2.6.3. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi
Ảnh hưởng của các chất KTST lên khả năng tái sinh chồi của đoạn mắt đốt tự nhiên
Đoạn mắt đốt tự nhiên sau khi khử trùng được cấy lên môi trường cơ bản MS chứa 3,0% saccharose, 0,8% agar và bổ sung riêng lẻ BAP hoặc Kin hoặc BAP kết hợp với IBA ở các nồng độ khác nhau để nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ đoạn mắt đốt. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất KTST lên khả năng tái sinh chồi của đoạn mắt đốt tự nhiên được thể hiện qua bảng 2.46.
Sau khoảng 2 tuần nuôi cấy, đoạn mắt đốt bắt đầu hình thành chồi. Ở tất cả các loại môi trường nghiên cứu, các đoạn mắt đốt đều hình thành chồi; trong đó, môi trường bổ sung riêng lẻ BAP và môi trường bổ sung BAP kết hợp với IBA có thời gian xuất hiện chồi sớm hơn môi trường bổ sung riêng lẻ Kin. Tất cả các đoạn mắt đốt đều có tạo callus ở bề mặt vết cắt tiếp xúc với môi trường.
Bảng 2.46. Ảnh hưởng của chất KTST lên khả năng tái sinh chồi của đoạn mắt đốt Chất KTST (mg/l) Tỷ lệ nảy chồi
BAP IBA Kin (%)
0 1 2 2 1 0 0 0 0 0 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0,5 1,0 0 100 100 100 100 100 100 0 2,33c 1,16a 1,83b 1,66b 1,00a 1,00a
Chồi to,phát triển tốt, lá vừa Chồi to, phát triển chậm, lá vừa Chồi to, phát triển tốt, lá vừa Chồi to, phát triển tốt, lá vừa Chồi vừa, phát triển chậm, lá to Chồi vừa, phát triển kém, lá vừa
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng cột thể hiện sai khác có ý nghĩa với p< 0,05.
Từ bảng 2.46. cho thấy, môi trường bổ sung 1 mg/l BAP cho hiệu quả tái sinh chồi cao nhất với số chồi trung bình là 2,33chồi/mẫu. Nếu tăng nồng độ BAP lên 2 mg/l thì hiệu quả tái sinh chồi giảm xuống (với số chồi trung bình là 1,16 chồi/mẫu), chồi sinh trưởng chậm hơn và khối callus ở bề mặt vết cắt cũng lớn hơn so với trên môi trường bổ sung 1 mg/l BAP. Có lẽ điều này làm ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của chồi.
Đối với môi trường bổ sung BAP kết hợp với IBA, số chồi trung bình thu được thấp hơn so với khi bổ sung riêng lẻ BAP với 1,83 chồi/mẫu ở tỷ lệ BAP/IBA là 2/0,5 và 1,66 chồi/mẫu ở tỷ lệ BAP/IBA là 1/0,5. Sự chênh lệch số chồi trung bình thu được giữa hai tỉ lệ kết hợp này là không có ý nghĩa về mặt thống kê. Đồng thời, không phải nồng độ BAP cao thì khả năng tái sinh chồi cao mà đòi hỏi phải có sự phù hợp trong tỷ lệ giữa BAP và IBA.
Sự tái sinh chồi thấp nhất khi bổ sung riêng lẻ Kin ở các nồng độ khác nhau. Trong đó, tất cả các mẫu nuôi cấy chỉ cho một chồi và tốc độ sinh trưởng của các chồi này cũng thấp hơn rất nhiều so với khi sử dụng các chất KTST khác.
Như vậy, ở cây hồ tiêu thì hàm lượng auxin nội sinh khá lớn nên chỉ cần bổ sung hàm lượng cytokinin ngoại sinh vừa đủ là tăng khả năng tái sinh chồi và loại cytokinin thích hợp là BAP.
Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi của callus có nguồn gốc từ hạt
Ảnh hưởng của BAP kết hợp IBA và Kin lên khả năng tái sinh chồi của callus có nguồn gốc từ hạt
Callus có nguồn gốc từ hạt sau 8 tuần nuôi cấy được cấy chuyển sang môi trường MS chứa 3,0% saccharose, 0,8% agar có bổ sung BAP kết hợp Kin và IBA ở các nồng độ khác